免疫健全小鼠肿瘤模型中对生物发光成像报告基因的免疫反应研究：为肿瘤免疫研究选择合适报告基因的关键依据

《Molecular Imaging and Biology》：Immune Response to Bioluminescence Imaging Reporters in Murine Tumor Models

为解决肿瘤免疫研究中成像报告基因可能引发免疫反应干扰研究结果的问题，研究人员开展了对生物发光报告基因免疫反应的研究。结果显示，与红移萤火虫荧光素酶（RLuc）相比，叩甲绿荧光素酶（CBG）免疫原性低，不影响肿瘤生长。这为选择合适报告基因提供重要参考。

　　在癌症研究领域，实时成像技术为肿瘤生物学研究带来了重大突破。光学成像报告基因的出现，让科研人员能够非侵入性地研究肿瘤的基因表达、细胞增殖和转移等过程。其中，荧光报告基因和生物发光报告基因是两种重要的成像工具。荧光报告基因自 20 世纪 60 年代发现绿色荧光蛋白（GFP）后得到广泛应用，它能使细胞在荧光显微镜下清晰可见；生物发光报告基因则依赖荧光素酶催化的生化反应产生光信号，因其背景噪音低、可直接测量活细胞活性等优势，在肿瘤监测中备受青睐。

然而，早期使用肿瘤细胞表达生物发光报告基因的研究多在免疫缺陷小鼠模型中进行，这类小鼠缺乏功能性的宿主免疫系统，不会对报告基因产生免疫反应。但随着对肿瘤 - 免疫相互作用研究的深入，科研人员逐渐将目光转向免疫健全的小鼠模型，因为这更能真实反映免疫系统在肿瘤发生和癌症治疗中的作用。可问题也随之而来，一些生物发光报告基因并非哺乳动物自身所有，被免疫系统识别为外来异物，可能引发免疫反应。比如，树突状细胞会处理并呈递这些非自身抗原，激活细胞毒性 T 细胞，进而攻击并清除表达报告蛋白的肿瘤细胞，这无疑会干扰肿瘤发展的自然进程，影响研究结果的准确性。所以，寻找一种不会引发免疫反应、不影响肿瘤细胞生长的合适报告基因，成为肿瘤免疫研究的关键问题。

为了解决这一难题，美国西弗吉尼亚大学（West Virginia University）的研究人员 Angisha Basnet、Dylan D. Thomas 等人开展了一项关于生物发光报告基因免疫原性的研究，相关成果发表在《Molecular Imaging and Biology》杂志上。

研究人员采用了多种技术方法来探究这一问题。首先，利用细胞培养技术，在体外培养了四种不同的癌细胞系，包括胰腺导管腺癌细胞系（KPCY6419 和 KPCY6422）和黑色素瘤细胞系（YUMM1.7 和 YUMM3.3），并分别使其稳定表达两种生物发光报告基因 —— 红移萤火虫荧光素酶（RLuc）和叩甲绿荧光素酶（CBG）。然后，运用流式细胞术分析肿瘤细胞和免疫细胞的组成及活化情况；通过细胞因子阵列和酶联免疫吸附试验（ELISA）检测细胞分泌的细胞因子水平；构建皮下肿瘤模型和原位肿瘤模型，将癌细胞接种到免疫健全的 C57BL/6 小鼠体内，观察肿瘤的生长情况，利用生物发光成像和计算机断层扫描（CT）等技术对肿瘤进行监测和定位。

研究结果如下：

• 肿瘤细胞表达红移萤火虫荧光素酶无法在体内生长：将稳定表达红移萤火虫荧光素酶和绿色荧光蛋白（RLuc - GFP）的胰腺导管腺癌细胞系（KPCY6419 和 KPCY6422）接种到免疫健全的 C57BL/6 小鼠体内，令人意外的是，未能观察到可触及的肿瘤。虽然在体外，这些细胞的增殖与亲本细胞没有显著差异，但在体内却表现出截然不同的结果。进一步分析发现，KPCY6419 RLuc - GFP 细胞分泌的角质细胞趋化因子（KC）、脂多糖诱导的 CXC 趋化因子（LIX）和单核细胞趋化蛋白 - 1（MCP - 1）等细胞因子水平显著升高，不过这些细胞因子的变化与体内肿瘤生长的关系并不明确。这表明，RLuc - GFP 报告基因的稳定整合虽不影响体外增殖，但却损害了肿瘤细胞在免疫健全小鼠体内的生长能力。
• 叩甲绿荧光素酶的表达不影响体内肿瘤生长：鉴于 RLuc - GFP 报告基因的问题，研究人员评估了另一种生物发光报告基因 —— 叩甲绿荧光素酶和绿色荧光蛋白（CBG - GFP）。实验结果显示，无论是胰腺导管腺癌细胞系还是黑色素瘤细胞系，表达 CBG - GFP 的细胞在体外的增殖速率与亲本细胞相似。在体内，将表达 CBG - GFP 的肿瘤细胞接种到免疫健全的 C57BL/6 小鼠体内，其肿瘤生长速率也与亲本细胞相近。这说明 CBG - GFP 报告基因不会干扰体外细胞增殖和体内肿瘤生长。
• CBG - GFP 稳定整合对细胞分泌细胞因子的影响较小：研究人员检测了亲本细胞和表达 CBG - GFP 的肿瘤细胞培养上清液中的细胞因子水平。结果发现，不同细胞系中细胞因子的变化各不相同。在 KPCY6419 细胞中，KC 和 LIX 细胞因子水平降低；在 KPCY6422 细胞中，KC 水平显著升高；在 YUMM1.7 细胞中，干扰素 - γ 诱导蛋白 - 10（IP - 10）、MCP - 1 和活化调节正常 T 细胞表达和分泌因子（RANTES）水平显著升高；而 YUMM3.3 细胞中，亲本细胞和表达 CBG - GFP 的细胞分泌的细胞因子没有显著差异。这表明，将成像报告基因整合到肿瘤细胞系中会影响细胞因子的分泌，但细胞因子分泌的改变并不能可靠地预测体内肿瘤的生长。
• 亲本和 CBG - GFP 标记的肿瘤在肿瘤免疫组成上无显著差异：研究人员评估了 CBG - GFP 报告基因的稳定整合是否会改变肿瘤内的免疫组成。结果显示，除了 KPCY6419 肿瘤中 CD4⁺ T 细胞显著增加（但总体占比低），以及 B16F10 CBG - GFP 肿瘤中单核细胞显著增加外，其他肿瘤的免疫组成没有显著差异。这表明，一般情况下，CBG - GFP 报告基因的整合不会改变肿瘤免疫微环境。
• CBG - GFP 报告基因在体内的应用优势：研究人员发现，使用 CBG - GFP 报告基因可以非侵入性地可视化和量化疾病进展。例如，通过二维生物发光成像和三维 CT 成像可以监测原位胰腺肿瘤的存在和生长；在黑色素瘤模型中，能够通过生物发光成像观察癌细胞的转移情况；利用皮肤窗口 chamber 对 YUMM1.7 CBG - GFP 肿瘤进行宏观活体成像和荧光显微镜成像，可以观察肿瘤行为及其与周围微环境的相互作用。

在研究结论和讨论部分，研究人员指出，他们的研究全面表征了 RLuc - GFP 和 CBG - GFP 报告基因的免疫原性。研究表明，体外增殖实验虽然有助于确认报告基因的稳定整合，但不足以预测体内肿瘤生长情况。RLuc - GFP 报告基因导致体内肿瘤无法生长，很可能是因为其免疫原性引发了 T 细胞的增强活化和细胞毒性。相比之下，CBG - GFP 报告基因免疫原性低，表达 CBG - GFP 的肿瘤细胞在体内的生长速率与亲本肿瘤细胞相似，对肿瘤免疫细胞组成的影响也较小。这一研究结果为在免疫健全小鼠模型中研究肿瘤 - 免疫相互作用时选择合适的报告基因提供了重要依据，强调了在使用成像报告基因进行体内肿瘤研究时评估其免疫原性的重要性。

不过，该研究也存在一些局限性。比如，仅在肿瘤终点评估了免疫组成，可能会错过早期关键的免疫反应；部分细胞系存在报告质粒丢失的问题，影响实验结果的稳定性；CBG - GFP 在其他小鼠模型中的免疫原性尚不明确；研究使用的是多克隆报告细胞群体，单克隆细胞的免疫原性差异有待进一步研究。但尽管如此，这项研究仍为肿瘤免疫研究领域提供了宝贵的参考，为后续更深入的研究奠定了基础。