改写解冻复水方案：慢冻人卵母细胞与玻璃化冻存效果相当的新突破

《Reproductive Biology and Endocrinology》：Equivalent outcomes of human oocytes after vitrification or slow freezing with a modified rehydration protocol

在辅助生殖领域，人卵母细胞慢冻法效率常被质疑。研究人员对比传统与改良慢冻卵母细胞复苏法及玻璃化冷冻法效果。结果显示，改良复水法可提高慢冻卵母细胞存活率等，临床妊娠、着床率与玻璃化冷冻相当，为相关患者带来新希望。

　　在生殖医学的舞台上，卵母细胞的冷冻保存一直是备受瞩目的焦点。多年来，慢冻法作为一种经典的卵母细胞和胚胎冷冻保存技术，在生殖医学和动物繁殖领域广泛应用。然而，自 1985 年玻璃化冷冻法问世后，其以独特的优势逐渐受到更多关注，尤其是最小体积或微体积（MV）玻璃化冷冻，成为某些动物物种（如牛、猪）卵母细胞长期低温保存的首选方法。

对于人类卵母细胞而言，慢冻法却面临诸多挑战。早期，直接沿用胚胎冷冻方案使得人卵母细胞解冻后的存活率长期处于较低水平。尽管通过提高冷冻培养基中蔗糖浓度，一定程度上提升了存活率，但与玻璃化冷冻的卵母细胞相比，临床妊娠（CPR）和着床（IR）率在多数报道中仍不尽人意。并且，卵母细胞冷冻保存体系中，解冻方法及基于分裂期胚胎解冻 / 复水程序的丙二醇（PrOH）解冻后去除方法，多年来改进甚少，效果不佳。

在此背景下，“nOvum” Fertility Clinic、华沙生命科学大学转化医学中心以及国际分子和细胞生物学研究所的研究人员 Krzysztof Papis、Karolina Hardej 等人开展了一项研究。他们旨在挑战传统认知，探究改良后的慢冻卵母细胞复水方法与玻璃化冷冻卵母细胞在各项指标上的差异。研究成果发表在《Reproductive Biology and Endocrinology》杂志上，为卵母细胞冷冻保存技术的发展带来了新的曙光。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，对患者进行卵巢刺激，使用尿促性腺激素（MENOPUR）或重组 FSH（PUREGON、GonalF ）联合 GnRH 拮抗剂（Orgalutran、Cetrotide），或 GnRH 激动剂（Diphereline、Decapeptyl）进行不同方案的刺激。卵母细胞采集后，分别进行慢冻、玻璃化冷冻操作。慢冻采用特定的程序，玻璃化冷冻则使用封闭法。解冻或复温后，对卵母细胞进行化学激活、体外受精（ICSI），并在特定培养基中培养胚胎，最后进行胚胎移植。

研究结果如下：

1. 实验室结果回顾性分析：共分析了 200 个解冻 / 复温周期中的 1203 个卵母细胞。发现采用改良蔗糖介导复水法解冻的卵母细胞（423/471，89.8%）和玻璃化冷冻后复温的卵母细胞（559/623，89.7%），存活率显著高于传统复水法（71/109，65.1%，P≤0.0001 ）。玻璃化冷冻卵母细胞的受精率高于传统处理组（P≤0.05 ），但第三天胚胎发育率低于慢冻卵母细胞组（64.9 vs. 87.2 或 75.4%，P≤0.05 ）。不过，从解冻 / 复温后存活卵母细胞计算的胚胎发育率在各组间无差异。
2. 临床结果回顾性分析：改良解冻后复水法和玻璃化冷冻法的胚胎移植后着床率和妊娠率，均高于传统复水法。传统治疗期有 4 个孩子出生，改良复水法实施后有 23 个孩子出生（包括 4 对双胞胎），玻璃化冷冻组有 28 个孩子出生（其中一对双胞胎有一个胎儿流产）。
3. 化学激活效果：共使用 233 个卵母细胞分析慢冻与玻璃化冷冻卵母细胞经化学激活后的存活率和发育率。136 个慢冻卵母细胞经改良三步蔗糖复水法处理后，125 个存活（91.9%）；97 个玻璃化冷冻 / 复温卵母细胞中，96 个存活（99.0%）。慢冻卵母细胞激活率为 76.0%，玻璃化冷冻卵母细胞为 64.6%，两组差异无统计学意义。慢冻卵母细胞激活后第三天胚胎发育率显著高于玻璃化冷冻卵母细胞（P≤0.01 ）。

研究结论表明，改良后的慢冻卵母细胞解冻复水方法，显著提高了卵母细胞存活率、受精率、发育或激活率，在临床应用中，妊娠率、着床率和出生率与玻璃化冷冻卵母细胞相当。这一成果为那些在体外受精（IVF）诊所中存储慢冻卵母细胞的患者带来了新希望。

讨论部分指出，改良复水法中，0.5M 蔗糖复水第一步适度抑制了卵母细胞肿胀，1 分钟的时间限制避免了细胞过度收缩；第二步 0.1M 蔗糖溶液促进细胞复水并防止进一步肿胀，该方法的有效性得到了卵母细胞高存活率及胚胎学和临床数据的证实。同时，研究也存在一些局限性，如卵母细胞采集到冷冻的时间不理想，可能影响受精率；研究时间跨度长，存在冷冻保存溶液、培养基和培养条件的变化；传统方法处理的卵母细胞数量较少等。但即便如此，改良复水法展现出的高存活率和良好临床数据，使其更接近玻璃化冷冻卵母细胞的效果。

此外，目前人们对卵母细胞玻璃化冷冻的潜在副作用有所担忧，如可能导致某些表观遗传修饰，影响卵母细胞和胚胎的受精及受精后表现，进而引发健康问题。而慢冻法是否存在类似风险尚不明确。因此，研究人员认为有必要对慢冻和玻璃化冷冻卵母细胞发育成的胚胎进行表观遗传筛查和比较，避免因误判而放弃可能更安全的冷冻保存方法。

总体而言，该研究为卵母细胞冷冻保存技术提供了新的思路和方法，虽然还需要进一步的前瞻性随机临床试验加以验证，但无疑为生殖医学领域的发展做出了重要贡献，为众多渴望生育的患者带来了更多希望。