揭示 Retromer 与 Vps5-Vps17 SNX-BAR 蛋白组装的分子机制及其重要意义

在细胞内膜泡运输中，Retromer 与 Vps5-Vps17 的相互作用机制不明。为解决此问题，研究人员开展了关于 Retromer 与 Vps5-Vps17 SNX-BAR 蛋白组装机制的研究。结果发现 Vps5 通过特定序列与 Retromer 结合，这为理解其进化和相关疾病机制提供依据。

　　在细胞的微观世界里，内膜系统的运输就像一场有条不紊的物流盛宴，各种蛋白质和脂质货物在不同的 “站点” 之间精准转运，维持着细胞的正常运转。其中，内体（endosome）作为重要的 “转运枢纽”，负责对跨膜货物蛋白和脂质进行分类与运输。Retromer 复合物是这场运输盛宴中的关键 “调度员”，它在所有真核生物中都介导着内体对跨膜蛋白的回收过程，从单细胞的酵母到复杂的人类细胞，都离不开它的 “辛勤工作”。

Retromer 由 Vps26、Vps29 和 Vps35 三个亚基组成，在酵母中，它与 Vps5 和 Vps17 分选衔接蛋白（sorting nexins，SNXs）形成五聚体复合物，承担着从内体到高尔基体的货物回收任务，比如负责将羧肽酶 Y（carboxy peptidase Y，CPY）受体 Vps10 从内体运回高尔基体，确保细胞内物质的正常循环利用 。然而，随着研究的深入，科学家们发现这个看似有序的运输系统中存在一些难以解释的谜团。

在以往的研究中，冷冻电镜断层扫描（cryoelectron tomography，CryoET）技术揭示了 Retromer 与 Vps5 结合形成的膜管结构，发现 Vps26 亚基的二聚体与 Vps5 的膜近端结构域相互作用，而 Vps29 亚基却远离膜表面 。令人困惑的是，尽管 Vps29 在结构上与膜和 Vps5 的直接接触并不明显，但研究表明它对于 Vps5-Vps17 与 Retromer 的结合至关重要，而 Vps26 在共免疫沉淀实验中对这种相互作用却并非必需 。此外，Vps5 的 N 端无序结构域在 CryoET 重建中无法被清晰观察到，但它同样是与 Retromer 相互作用所必需的。这些矛盾的结果让科学家们对 Retromer 与 Vps5-Vps17 的相互作用机制产生了浓厚的兴趣，也促使他们深入探索，以解开这个谜团。

为了揭开这些谜团，来自澳大利亚昆士兰大学（the University of Queensland）、瑞士洛桑大学（University of Lausanne）、德国马克斯?普朗克多学科科学研究所（Max Planck Institute for Multidisciplinary Sciences）和澳大利亚新南威尔士大学（University of New South Wales）的研究人员 Kai-En Chen、Vikas A. Tillu、Navin Gopaldass 等组成的团队展开了深入研究 。他们通过一系列巧妙的实验，终于为我们揭示了 Retromer 与 Vps5-Vps17 SNX-BAR 蛋白组装的分子机制，相关研究成果发表在《Nature Communications》杂志上。

研究人员在研究过程中运用了多种先进的技术方法。结构预测方面，使用了 Alphafold2-multimer 结合 ColabFold 管道进行蛋白结构预测，以此来探索蛋白间潜在的结合界面。为了验证预测结果，他们通过结晶学方法，成功获得了小鼠 VPS29 与 ctVps5 肽的复合物晶体结构，并解析出其原子层面的结构信息。冷冻电镜断层扫描技术被用于观察 Retromer 与 Vps5-Vps17 在膜管上的组装结构，帮助研究人员直观地了解复合物在膜上的形态和排列方式。此外，他们还运用了生物化学方法，如 GST pull-down 实验、等温滴定量热法（isothermal titration calorimetry，ITC）分析等，来研究蛋白质之间的相互作用和结合亲和力，从多个角度全面地探究了 Retromer 与 Vps5-Vps17 的组装机制。

研究结果

1. Vps5 的 N 端无序区域介导与 Retromer 的高亲和力相互作用：研究人员以嗜热毁丝霉（Chaetomium thermophilum）的 Vps5（ctVps5）为研究对象，通过 GST pull-down 实验发现，ctVps5 的全长蛋白能与 ctRetromer 三聚体以及 ctVps29-ctVps35 亚复合物强烈结合，而进一步的截断实验表明，ctVps29-ctVps35 亚复合物主要与 ctVps5 的 N 端无序区域（IDR）结合，其中 51-100 位氨基酸残基是这种相互作用所必需且足够的 。ITC 分析也证实，ctRetromer 与 ctVps5_51-100的结合常数（K_d）为 660 nM，而其他 Vps5 片段，如 PX 和 BAR 结构域，则无法与 Retromer 在溶液中相互作用 。通过序列比对发现，Vps5 的 N 端 IDR 在不同物种间差异较大，但在真菌的 Pezizomycotina 细分中，存在一个保守的双 PL 基序（73DPLGPL78 in ctVps5），这一基序与之前发现的能结合人类 Retromer 亚基 Vps29 的序列相似 。同时，ITC 实验显示，ctRetromer 能与 ctVps5 的 N 端结构域结合，而人类 SNX1 与人类 Retromer 在相同条件下却无明显结合，进一步证明了该基序在介导 Vps5 与 Retromer 结合中的重要性。
2. Vps5 含 PL 的基序对 Retromer 结合至关重要：为了验证 Vps5 中含 PL 基序的重要性，研究人员进行了一系列实验。ITC 实验表明，加入抑制性环肽 RT-D3 会显著降低全长 ctVps5 与 ctRetromer 的结合亲和力，而不与 Vps29 结合的突变对照肽 RT-D1 L7E 则对这种结合没有影响 。质谱分析和脂质体结合实验也得到了类似的结果，RT-D3 能阻断 ctRetromer 与 ctVps5 的结合，减少 ctRetromer 在脂质体上的招募，而对照肽 RT-L4 则不影响这种招募 。这些实验充分证明，ctVps5 的 PL 基序与 Vps29 的相互作用对于 ctVps5 介导的 ctRetromer 复合物的膜招募至关重要。
3. Vps5 与 Retromer 相互作用的结构基础：研究人员利用 Alphafold2-multimer 预测了 Vps5 与 Retromer 相互作用的潜在结合界面，发现 ctVps5 的 N 端区域与 ctRetromer 存在强相关性，其中的 PL 基序在结合中起关键作用 。通过解析小鼠 VPS29 与 ctVps5 肽（72DDPLGPLGA80）的复合物晶体结构，他们进一步证实了这一预测 。在晶体结构中，ctVps5 肽与 VPS29 的结合模式与 Alphafold2 预测模型存在一定差异，但都表明 PL 基序在结合中发挥着重要作用 。研究人员推测，晶体结构中的结合模式可能是一种较弱的二级构象，而 Alphafold2 预测的模式是酵母蛋白相互作用的主要模式。
4. 与 Vps5 的高亲和力相互作用源于与 Vps29 和 Vps35 结合的协同作用：根据模型预测，ctVps5 的 53-71 位氨基酸残基（位于核心 PL 基序上游）与 ctVps29-ctVps35 界面形成广泛接触 。这一机制在不同酵母物种中相对保守，且这些区域包含多个赖氨酸或精氨酸残基以及疏水残基组成的 [K/R]Φ 基序，该基序与 Vps29 和 Vps35 界面的残基相互作用 。ITC 实验表明，同时包含 [K/R]Φ 和 PL 基序的 ctVps5_51-100与 ctRetromer 的结合亲和力远高于只包含单个基序的片段 。此外，一些酵母 Vps5 还存在与 Vps35 α 螺旋螺线管后侧结合的序列，类似于人类 FAM21 蛋白中的 LFa 重复基序，这进一步增强了 Vps5 与 Retromer 的结合亲和力。
5. Retromer 与 Vps5-Vps17 异二聚体复合物在膜管上的组装：在酵母中，Vps17 是 Vps5 的功能伙伴，二者通过 C 端 BAR 结构域形成异二聚体 。ITC 实验显示，ctVps17 的 N 端无序区域与 ctRetromer 无明显结合，而 GST pull-down 实验表明，GST 标记的 ctVps5-ctVps17 异二聚体能与 ctRetromer 强烈结合，且这种结合可被 RT-D3 阻断，说明 ctVps5 的含 PL 基序的 N 端结构域在异五聚体复合物组装中起主要作用 。通过冷冻电镜和冷冻电镜断层扫描技术，研究人员发现 Retromer 与 Vps5-Vps17 异二聚体在膜管上形成的蛋白涂层与 Retromer 与 Vps5 同二聚体形成的涂层形态相似，但 Vps5-Vps17 异二聚体为 Vps26 二聚体提供了更受限的对接位点，导致涂层具有单一的主要组织形式。
6. PL 基序对酿酒酵母 Vps5 招募 Retromer 至关重要：研究人员利用支持膜管（supported membrane tube，SMT）实验，研究了 Vps5 N 端对五聚体涂层形成动力学的影响 。他们将携带 mRuby 的 scRetromer 和标记 GFP 的 scVps5-scVps17 异二聚体（scSNX-BAR）与 SMTs 孵育，通过添加竞争肽 RT-D3 或对照肽来研究 PL 基序的作用 。结果发现，RT-D3 能强烈抑制 scRetromer 的招募，阻止膜收缩，而对照肽则无此影响 。这表明 Vps5 的 N 端，尤其是 PL 基序，对于 Retromer 的相互作用和五聚体复合物的组装至关重要。
7. Retromer 与 Vps5 N 端结构域的相互作用对 Vps10 回收至关重要：研究人员通过两种实验方法验证了 Vps5 与 Retromer 相互作用相关序列的重要性 。一种方法是利用 Vps5-Retromer 结合缺失导致液泡强烈碎片化的现象，另一种方法是检测 Vps10（一种典型的 CPY 受体货物）的分选情况 。他们构建了酿酒酵母 VPS5 基因敲除细胞（vps5Δ），并表达 C 端融合 mNeonGreen 的 Vps10 。结果发现，野生型 Vps5 的重新引入能恢复大液泡的形成和 Vps10 的正常分选，而只包含 PX 和 BAR 结构域的 Vps5（vps5Δ1-280）则无法拯救分选缺陷和液泡碎片化 。PL 基序单点突变（Vps5（L196R））导致 Vps10 回收部分缺陷，而同时破坏多个结合位点的四重突变（Vps5（L121G/F122G/F161E/L196R））则导致严重的 Vps10 回收缺陷和液泡碎片化，与 vps5Δ 细胞相似 。这些结果证实了 scVps5 的 PL、[K/R]Φ 和 LFa 基序在与 Retromer 相互作用和体内功能中的重要性。

研究结论与讨论

这项研究成功地揭示了 Retromer 与 Vps5-Vps17 SNX-BAR 蛋白组装的分子机制，解决了长期以来关于它们相互作用的争议。研究表明，Vps5 在不同酵母物种中，其 N 端无序区域都含有一个保守的 Vps29 结合 PL 基序，这一基序对于 Retromer 在溶液中的结合以及招募 Retromer 形成功能性膜组装复合物至关重要 。此外，酵母 Retromer 与 Vps5 的高亲和力结合还依赖于 [K/R]Φ 基序和 LFa 基序等其他相互作用 。这些发现与之前的 CryoET 结构和细胞研究结果相吻合，进一步完善了我们对 Retromer 和 SNX-BAR 组装模型的理解。

研究还发现，虽然之前的 CryoET 研究使用的是 Vps5 同二聚体的简化复合物，但 Vps5-Vps17 异二聚体也能与 Retromer 组装形成类似形态的膜涂层 。Vps17 在 Retromer 介导的运输中可能起着区分特定货物的作用，尽管它对于 Retromer 的相互作用和膜组装不是必需的 。

从进化的角度来看，Vps5 和 Vps17 的 N 端无序区域在不同物种中具有不同的功能 。人类的 SNX1 和 SNX2（Vps5 的同源物）虽然缺乏酵母 Vps5 中的 PL 基序，但却含有能与 Retromer 货物适配器 SNX27 结合的 DLF 基序 。这表明在进化过程中，SNX-BAR 蛋白与 Retromer 的相互作用机制发生了变化，这种变化可能与不同物种的细胞需求和功能适应性有关。

这项研究为我们深入理解细胞内膜泡运输的分子机制提供了重要依据，也为开发针对 Retromer 相关疾病（如阿尔茨海默病、帕金森病和癌症）的治疗方法奠定了基础 。通过精准地靶向 Retromer 的特定界面，有望开发出稳定和调节其功能的治疗药物，为相关疾病的治疗带来新的希望。