Hsp90 抑制剂对 BiP - Grp94 客户蛋白加载机制的影响及意义

为探究 Hsp90 抑制剂如何影响客户蛋白从 BiP 转移到 Grp94 的过程，研究人员开展了关于 BiP/Grp94 系统的研究。结果发现部分抑制剂可阻碍 Grp94 客户加载构象，破坏三元复合物。该研究为合理设计 Hsp90 药物开辟新途径。

　　在生命的微观世界里，细胞内的蛋白质如同精密运转的机器零件，需要 “分子伴侣” 来协助它们正确折叠和发挥功能。Hsp70 和 Hsp90 就是这样一对重要的分子伴侣家族，其中 Hsp90 更是抗癌药物研发的热门靶点，众多 ATP 竞争性抑制剂正在临床试验中接受检验。然而，客户蛋白从 Hsp70 转移到 Hsp90 的过程，就像一场复杂的接力赛，其中涉及的客户递送、加载和捕获步骤，以及抑制剂对这些步骤的影响，却还迷雾重重。尤其是在不同细胞器中，Hsp90 的功能和抑制剂的作用机制可能存在差异，这使得研究更加扑朔迷离。为了揭开这些谜团，来自美国布兰迪斯大学（Brandeis University）的研究人员深入探索了内质网驻留的 BiP/Grp94 系统（Hsp70/Hsp90 旁系同源物），相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究人员主要运用了多种实验技术来深入探究这一复杂的过程。其中，荧光共振能量转移（FRET）技术包括单分子 FRET（smFRET）和体相 FRET，通过检测荧光信号的变化来监测蛋白质构象的改变；ATP 酶活性测定用于衡量 Grp94 水解 ATP 的能力，以了解其功能状态；荧光偏振（FP）实验则用于研究蛋白质之间的相互作用。

研究结果如下：

• 部分抑制剂阻碍 Grp94 加载状态：通过体相 FRET 和 smFRET 实验发现，不同的 Hsp90 抑制剂对 Grp94 构象影响各异。像 HSP990 和 XL888 可显著抑制 BiP 诱导的 Grp94 向高 FRET 的 C’状态转变，而 AUY922 则无此抑制作用。这表明部分抑制剂允许 BiP 推动 Grp94 进入 C’构象，而另一些则会阻断这一变化。
• 空间位阻解释抑制剂作用差异：研究人员参考 Grp94 C’状态的两种潜在模型 ——Trap1 卷曲螺旋结构和 Hsp90α 半封闭结构，发现 XL888 和 HSP990 与加载状态下 Grp94 核苷酸结合口袋存在空间位阻冲突，而 AUY922 则不存在。通过构建 Grp94_F199A和 Grp94_L163A突变体，证实了与 HSP990 冲突的关键残基是 F199。
• BiP 通过界面 II 驱动 Grp94 构象变化：构建破坏 BiP 与 Grp94 界面 II 的突变体 BiP_D187A和 BiP_I191A，研究发现这些突变会消除 BiP 诱导的 Grp94 构象变化，降低 Grp94 的 ATP 酶活性和 ATP 依赖的闭合速率，同时显著降低 BiP 与 Grp94 的结合亲和力。这表明界面 II 在 BiP 稳定 Grp94 加载构象、加速其 ATP 依赖闭合过程中起着关键作用。
• 单体 proIGF2 客户构建体用于客户加载分析：为了研究客户蛋白胰岛素样生长因子 2 前体（proIGF2）的加载过程，研究人员设计了一种单体 proIGF2 构建体 proIGF2_{25 - 120}。通过分析尺寸排阻色谱（SEC）、动态光散射（DLS）和荧光偏振实验结果，证明该构建体为单体且能与 BiP 稳定结合，适合用于研究客户从 BiP 到 Grp94 的加载过程。
• 抑制剂和界面 II 对客户加载的影响：FP 实验显示，Grp94 单独存在时与客户结合亲和力低，而 BiP、proIGF2_{25 - 120}和 Grp94 可形成三元复合物。界面 I 突变 Grp94_K467A会完全破坏三元复合物，界面 II 突变（BiP_D187A和 BiP_I191A）显著降低复合物稳定性。加载不兼容的抑制剂 XL888 和 HSP990 会破坏三元复合物，而加载兼容的抑制剂 AUY922 则适度增强其稳定性。

综合研究结论和讨论部分，该研究揭示了 Hsp90 抑制剂与 Grp94 加载状态的不同兼容性，这种差异源于抑制剂与加载状态下 Grp94 核苷酸结合口袋的空间位阻冲突。基于此，有望以半封闭结构为基础进行合理药物设计，更精准地控制 Hsp90 抑制剂的生物学效应。同时，研究发现界面 II 在 BiP/Grp94 协同工作以及客户加载过程中起着关键作用，这为进一步理解 Hsp70/Hsp90 系统在不同细胞器中的功能提供了重要线索，也为后续研究客户从 BiP 到 Grp94 的转移过程提供了有力工具。但目前仍不清楚 Hsp90 的半封闭结构和卷曲螺旋结构是否能完全代表 Grp94 加载状态，还需要更多研究来确定与 Grp94 C’ FRET 状态相关的结构。总之，这项研究为抗癌药物研发和理解细胞内蛋白质折叠机制开辟了新方向，具有重要的理论和实践意义。