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为解决利什曼病治疗中锑剂治疗失败及两性霉素 B（AmB）体外耐受性差异问题，研究人员对 13 株临床分离的巴西利什曼原虫进行基因组分析。结果发现其基因组变异特征，揭示新代谢途径。这为深入了解 AmB 耐受性机制及开发新疗法提供依据。
利什曼病，这个听起来有些陌生却又实实在在威胁着人类健康的疾病，是由利什曼原虫属的原生动物通过白蛉叮咬传播的。它就像一个隐藏在暗处的 “健康杀手”，在热带和亚热带地区的 98 个国家兴风作浪，让无数人深受其害。利什曼病的临床表现十分多样，从内脏利什曼病（Visceral leishmaniasis，VL）到皮肤利什曼病（Cutaneous leishmaniasis，CL），再到黏膜利什曼病（Mucosal leishmaniasis，ML），每种类型都给患者带来不同程度的痛苦。
目前，利什曼病的治疗面临着诸多困境。五价锑盐（SbV）作为 CL 的一线治疗药物，其疗效却因寄生虫种类、地理来源和患者免疫状况的不同而大打折扣。当 SbV 治疗失败，或者在寄生虫对其高度耐药的地区，两性霉素 B（AmB）就成为了重要的二线治疗选择。然而，AmB 在治疗 CL 时的疗效也不稳定，尤其是针对 Leishmania (V.) 亚属感染的患者，治疗效果差异很大。更糟糕的是，临床中已经出现了对 AmB 耐受性较低的寄生虫分离株，这让本就艰难的治疗局面雪上加霜。为了深入了解寄生虫对 AmB 耐受性的机制，来自哥伦比亚多所大学（如 Universidad de los Andes、Universidad del Tolima、Universidad Nacional de Colombia 等）的研究人员展开了一项重要的研究。
研究人员从哥伦比亚 CL 患者的皮肤病变中获取了 13 株对 Glucantime? 治疗无反应的巴西利什曼原虫（Leishmania (V.) braziliensis）临床分离株，同时以 MHOM/BR/75/M2903 为参考菌株。他们对这些分离株进行了详细的表型特征分析，包括前鞭毛体的生长速率以及前鞭毛体和胞内无鞭毛体对 AmB 的敏感性评估。接着，通过全基因组测序、比较基因组学分析等技术手段，研究人员深入挖掘这些分离株的基因组特征。
研究结果
- 分离株的表型特征：通过每日计数绘制寄生虫生长曲线，计算出前鞭毛体的倍增时间。结果显示，约一半的分离株生长速率与参考菌株相似，另一半则生长较慢。在对 AmB 的敏感性方面，前鞭毛体阶段，A66 对 AmB 耐受性最高；无鞭毛体阶段，A28 和 A36 耐受性最强。此外，除 A28 和 A36 外，其他分离株在前鞭毛体阶段对 AmB 的耐受性高于无鞭毛体阶段。
- 基因组特征分析：对分离株进行 Illumina 全基因组测序，构建了包含 332,321 个单核苷酸多态性（Single Nucleotide Polymorphisms，SNPs）的基因组变异数据库。分析发现，临床分离株的杂合 SNP 数量比参考菌株高至少 75%，整体倍性约为二倍体，但部分染色体存在非整倍性。在比较 AmB 耐受性分离株（A36 和 A28）与其他分离株的基因组时，发现 32 个 SNPs 可区分两者，不过经 Bonferroni 校正后，这些差异在正常全基因组关联研究（GWAS）中并不显著。此外，还鉴定出 106 个基因存在拷贝数变异（Copy Number Variation，CNV），部分基因与实验诱导的抗锑或抗 AmB 相关。
- 已知与 AmB 耐受性相关基因的分析：研究人员对 65 个先前报道与抗利什曼药物耐药相关的基因进行分析，发现 40 个基因在临床分离株中存在错义变异，但没有一个与先前报道的 AmB 耐药相关替换相符。不过，LbrM.30.2210 基因的 A28 独特错义变异可能与 AmB 耐药有关。
- 对 A28 或 A36 中重复区域基因的 RT-qPCR 分析：为评估基因组重复与 mRNA 水平的一致性，研究人员对 A28 和 A36 中重复区域的随机选择基因进行 RT-qPCR。结果表明，基因组重复与 mRNA 水平并不匹配，但生物蝶呤转运蛋白（putative）和 SET 结构域蛋白（putative）编码基因在两个分离株的两个生活阶段均持续上调。
研究结论和讨论
本研究通过对巴西利什曼原虫临床分离株的研究，揭示了与 AmB 耐受性相关的基因组特征。虽然整体倍性分析和 SNP 变异性分析未发现 AmB 耐受性最强和最弱的分离株基因组之间存在大的结构差异，但 A28 和 A36 的基因组在先前与 AmB 耐受性相关的基因中存在 CNV。此外，还发现了一些独特的 SNP，如 LbrM.23.1680 和 LbrM.30.2210 基因上的变异，可能与 AmB 耐受性有关。然而，不同分离株对 AmB 的耐受性机制复杂，A66 和 A28 在体内暴露于 AmB 后，体外耐受性机制不同；A36 在两个生活阶段对 AmB 的体外反应相似，但这些分离株缺乏共同的基因组特征。
这项研究的意义重大，它为进一步研究影响巴西利什曼原虫对 AmB 反应的因素奠定了基础。研究人员确定的候选基因可用于后续功能实验，有助于揭示寄生虫对 AmB 耐受性的分子机制，为开发更有效的抗利什曼病药物和治疗策略提供理论依据，有望改善全球利什曼病患者的治疗现状。
在研究过程中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：首先是寄生虫培养、感染及 DNA 制备技术，从患者皮肤病变获取巴西利什曼原虫临床分离株进行培养，感染 U937 细胞并制备 DNA；其次是药敏试验技术，包括前鞭毛体和无鞭毛体的 AmB 药敏试验，评估寄生虫对 AmB 的敏感性；然后是基因组分析技术，进行全基因组测序、序列比对、变异检测及 CNV 分析等，深入探究基因组特征；最后是基因表达分析技术，通过 RT-qPCR 检测特定基因的表达水平 。这些技术的综合运用，为研究的顺利开展和结论的得出提供了有力支持。
