基于 M13 噬菌体载体与 CRISPR 基因调控的大肠杆菌多细胞计算：开辟细胞间通信新路径

《Nature Communications》：Engineering intercellular communication using M13 phagemid and CRISPR-based gene regulation for multicellular computing in Escherichia coli

在合成细菌群落构建中，正交细胞间通信面临挑战。研究人员开展了 “Engineering intercellular communication using M13 phagemid and CRISPR-based gene regulation for multicellular computing in Escherichia coli” 的研究。结果成功构建多种逻辑门，该成果拓展了细胞间通信工具包，为合成微生物群落复杂信息处理奠定基础。

　　合成生物学作为一门前沿科学，致力于通过设计和构建人工生物系统来解决诸多领域的难题，在农业、医疗、制造业和环境保护等方面展现出巨大的应用潜力。其中，构建能够处理信息并产生可编程输出的遗传电路，打造生物计算设备，成为该领域的重要目标之一。受电子计算启发，布尔逻辑门在活细胞中的应用广泛，相关生物体被用于环境生物传感、植物应激响应调控以及治疗性细菌靶向特定微环境等方面。然而，在实际应用中，合成电路面临着诸多挑战，例如负载、遗传串扰、反馈效应、化学计量不匹配，以及特征明确的转录单元数量有限等问题，这些都限制了其计算能力的提升。

传统上，合成电路多采用蛋白质转录因子来调控基因表达。但 CRISPR（成簇规律间隔短回文重复序列） - 相关的基因调控技术，尤其是 CRISPR 干扰（CRISPRi），为解决这些问题提供了新的思路。CRISPRi 通过单链引导 RNA（sgRNA）将催化失活的 Cas9（dCas9）引导至启动子或编码区域，有效阻断转录过程，相较于传统方法，具有减少组件间串扰、降低代谢负担以及便于设计正交变体等优势。

与此同时，多细胞计算成为缓解合成电路问题的另一重要方向。在多细胞计算中，计算任务分布在不同的特化细胞类型中，有望实现单培养难以完成的复杂生物计算，具备更强的稳健性、模块化、可扩展性和组件可重用性。然而，将遗传电路扩展到多细胞群落的关键挑战在于建立有效的合成细胞间通信系统，也就是 “布线” 系统。尽管人们在利用群体感应分子和其他小分子构建细胞间通信系统方面做出了诸多努力，但这些小分子 “导线” 存在只能发送单一信息、真正正交的 “导线” 数量有限等问题。相比之下，电子计算机中的布线系统采用一对一连接，且同一类型导线可传输不同信息，这为多细胞群落通信系统的设计提供了理想参考。此前，已有研究尝试利用细菌结合或噬菌体来实现细胞间遗传物质的交换，以此构建细胞间通信 “导线”，但仍需进一步探索更高效、更灵活的通信方式。

在这样的背景下，瑞士洛桑大学（University of Lausanne）的 Hadiastri Kusumawardhani、Florian Zoppi、Roberto Avenda?o 和 Yolanda Schaerli 等研究人员开展了一项重要研究，相关成果发表在《Nature Communications》上。该研究将基于 M13 噬菌体载体的细胞间通信与 CRISPRi 基因调控相结合，用于大肠杆菌的多细胞计算，为解决合成细菌群落中正交细胞间通信的难题提供了创新方案。

研究人员在开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。首先是质粒和噬菌体载体的构建技术，通过设计特定的质粒和噬菌体载体，实现 sgRNA 等遗传信息的传递。其次，利用了 CRISPRi 技术，借助 sgRNA 引导 dCas9 来调控基因表达。此外，还运用了流式细胞术，对细胞荧光进行检测，从而分析基因表达的变化情况，以评估实验效果。

下面介绍具体的研究结果：

1. 建立 M13 噬菌体载体系统用于细胞间通信：研究人员采用 CRISPRi 技术进行基因调控，并将其与 M13 噬菌体载体系统相结合，以实现细胞间通信。他们构建了两种类型的信息噬菌体载体，分别基于 pBR322 和 RSF1030 质粒骨架。将这些噬菌体载体转化到含有辅助质粒的发送细胞中，同时接收细胞携带编码 dCas9 和 csy4 核酸酶的质粒以及报告质粒。通过共培养发送细胞和接收细胞，成功实现了噬菌体载体从发送细胞到接收细胞的转移，且转移效率较高，在 4 小时内转移率超过 97%。例如，基于 pBR322 的噬菌体载体在特定条件下，能使接收细胞中 sfGFP 的表达受到 13 - 25 倍的抑制，且超过 97% 的接收细胞报告基因水平受到抑制。改变 sgRNA 上游的启动子强度，可进一步提高 sfGFP 的抑制倍数，最高可达 60 倍。同时，实验验证了不同 sgRNA 的正交性，只有匹配的 sgRNA 和结合位点对才能抑制 sfGFP 的表达。
2. 诱导型噬菌体载体转移：为构建更复杂的生物计算电路，研究人员设计了诱导型噬菌体载体生产系统。通过调控 M13 噬菌体基因簇中蛋白质 VIII（P8）的表达来控制噬菌体载体的转移。他们删除辅助质粒 HP17_KO7 中的基因 VIII（gVIII），构建了新的辅助质粒 HP17ΔP8，此时噬菌体载体不再转移。随后，将基因 VIII 替换为 sfGFP，比较不同诱导型启动子对其表达的调控效果。最终，创建了一系列受诱导型启动子调控的第二辅助质粒（pHK316 - pHK346）。实验表明，在添加相应诱导剂后，能够实现噬菌体载体的诱导转移，且维持了正交性。利用诱导型噬菌体载体转移，研究人员还构建了 BUF（“Yes”）门，实现了对基因表达的激活调控。此外，与群体感应通信系统相比，噬菌体载体通信在液体培养中响应更快、效果更强。
3. 双输入布尔逻辑门：在建立单输入门的细胞间通信系统基础上，研究人员构建了双输入布尔逻辑门。以 NOR 门为例，其接收质粒包含两个不同的 sgRNA 结合位点，当发送细胞在诱导剂作用下转移携带相应 sgRNA 的噬菌体载体时，接收细胞中的 sfGFP 表达受到抑制，该 NOR 门的 Q - score 为 175.4。通过对 NOR 门进行改造，添加信号反相器（NOT 门），构建了 OR 门，实现了对 sfGFP 表达的激活，Q - score 为 10.2。构建 AND 门时，通过调整信号和优化启动子强度及诱导剂浓度，在优化条件下，当同时存在两种诱导剂时，sfGFP 表达有 11.5 倍的诱导增加，但由于启动子的泄漏，Q - score 为 2.6。对于 NAND 门，通过在发送细胞中诱导 P8 的抑制，成功构建了双输入 NAND 门，当两种输入都存在时，sfGFP 表达被抑制约 10.4 倍，Q - score 为 7.3。
4. 四输入逻辑门：为测试方法的可扩展性和稳健性，研究人员构建了四输入逻辑门。通过创建两种杂交诱导型启动子，使基因 VIII 的表达依赖于两种诱导剂的存在，从而控制噬菌体载体的转移。利用这些启动子，成功构建了四输入 AND 门和 NAND 门。四输入 AND 门在所有四个输入都存在时，sfGFP 表达增加 9 倍，Q - score 为 3.4；四输入 NAND 门在所有四个输入都存在时，sfGFP 表达被抑制 17.5 倍，Q - score 为 14.9。

在研究结论和讨论部分，该研究成功整合 CRISPRi 与噬菌体载体转移技术，建立了高效的细胞间通信系统，为合成微生物群落中复杂信息处理提供了有力工具。与群体感应通信相比，噬菌体载体通信在液体培养中具有明显优势，且该系统高度模块化，便于构建不同复杂程度的逻辑门。同时，研究也指出当前实验存在一些局限性，如发送细胞和接收细胞的生长速率不对称，以及接收细胞中 dCas9 的竞争问题等。未来研究可通过将辅助质粒整合到染色体中减轻负担，采用毒性更低的 dCas9 变体减少竞争效应，还可将 CRISPR 激活（CRISPRa）技术整合到基因调控电路中，进一步简化电路。此外，充分利用多细胞计算的优势，将输出信号分布到不同细胞类型，以及结合其他通信渠道，有望推动生物计算系统向更复杂的方向发展。

综上所述，该研究成果为工程化微生物群落进行复杂计算开辟了新途径，在生物计算、生物生产、生物修复、生物传感、诊断和治疗等领域具有广阔的应用前景，为合成生物学的发展提供了重要的理论和技术支持。