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本文介绍了 Major 等人开发的基于微孔阵列的微型胸腺类器官（mTOs）平台。该平台能从胎儿胸腺细胞生成 mTOs，有助于研究胸腺免疫生物学和 T 细胞发育，虽有局限，但前景广阔，为胸腺基质建模提供了有力工具。
胸腺类器官研究背景
胸腺类器官（thymic organoids）作为研究胸腺免疫生物学和 T 细胞发育的有力工具，近年来受到广泛关注。随着单细胞组学技术和高分辨率多重成像技术的发展，胸腺基质内的细胞和结构复杂性被逐步揭示。胸腺上皮细胞（TEC）和胸腺间充质 / 成纤维细胞群体存在广泛的异质性，并且在胸腺的不同区域有着精确的空间组织。
例如，非 TEC 基质细胞除了维持胸腺结构完整性以及 TEC 存活和增殖外，还具有许多关键功能。髓质区域的胸腺成纤维细胞可作为额外的自身抗原来源，促进胸腺细胞的阴性选择 。此外，包膜下区域一种独特的 DPP4+ 胸腺成纤维细胞亚群（capFibs），被认为是衰老相关胸腺退化过程中，性激素介导 TEC 损失的潜在调节因子 。而皮质区域的一群增殖性成纤维细胞，则参与了器官发生和重塑过程中胸腺大小的控制。这些发现强调了淋巴 - 基质和基质 - 基质相互作用在 T 细胞发育关键步骤中的重要作用。
现有胸腺类器官平台及局限性
为了重现胸腺的生理和功能，多种胸腺类器官平台应运而生。OP9 - DL1/DL4 和 MS5DL1/DL4 饲养细胞系统，可用于从干细胞生成新生 T 细胞；重新聚集胸腺器官培养和胎儿胸腺器官培养，能够模拟早期胸腺器官发生；基于生物材料水凝胶或天然支架的组织工程方法，则致力于在体内重现胸腺功能，应用于再生医学 。
尽管这些模型在确定 T 细胞发育的信号和细胞需求方面发挥了重要作用，但要重现胸腺内不同功能龛的淋巴 - 基质相互作用仍颇具挑战。
基于微孔阵列的微型胸腺类器官平台
在本期《Cell Reports》中，Major 及其同事介绍了一种基于微孔阵列的创新平台，可从胎儿胸腺细胞稳健且可重复地生成微型胸腺类器官（mTOs）。
具体操作是，将 E13.5 - E15.5 小鼠胸腺细胞解离后，接种到 96 孔 Gri3D 培养板（SUN Bioscience）上，每个孔含有 31 个 U 型底微孔阵列，表面涂有细胞排斥性聚乙二醇水凝胶。胎儿胸腺细胞会在每个微孔中自发组装成微型胸腺类器官（大小为 100 - 200μm），其中包含 TEC、胎儿胸腺间充质（FTM）和发育中的 T 细胞。
研究人员系统地研究了发育阶段、输入细胞类型和基质细胞比例等条件，确定了生成 mTOs 的最佳细胞组成：每微孔阵列含有1×105个 TEC、4×104个 FTM 和5×104个双阴性（DN）祖细胞（“Hi FTM” 条件），该组成能够支持 T 淋巴细胞生成。
mTOs 的结构和功能特征
利用报告基因小鼠品系（如用于标记 TEC 的 Foxn1 - GFP、标记 mTEC 的 RANK - Venus 和标记 cTEC 的 Cxcl12 - dsRed），研究人员通过活细胞成像发现，cTEC 和 mTEC 在每个 mTO 内可形成不同且分离的簇，重现了胸腺皮质和髓质区域的结构。
详细的免疫组化分析不仅证实了 cTEC 和 mTEC 区域的空间组织，还揭示了 mTOs 内 FTM 细胞的两种独特模式：一种是形成单层，分隔两层 TEC；另一种是组织成被 TEC 包围的中央簇。这表明 FTM 不仅提供关键的功能支持，还影响胸腺上皮微环境的空间组织和完整性 。
单细胞 RNA 测序的转录组分析，进一步揭示了 mTOs 的细胞复杂性和功能特性。mTOs 包含了几乎所有在天然胸腺中观察到的 TEC 主要亚型，包括最近新发现的 cTEC 和 mTEC 亚型 。此外，分析还揭示了 TEC 和 FTM 之间重要的调节相互作用。从 mTO 系统中去除 FTM，会导致基因表达谱发生显著变化，包括干扰素（IFN）信号通路和抗原呈递途径的下调。特别是，FTM 的缺失会导致主要组织相容性复合体（MHC） I 类和 II 类基因、Notch 配体 Dll4 以及其他参与 TEC 功能和 T 细胞发育的基因表达大幅降低。这表明 FTM 可能间接调节 IFN 信号通路，影响 TEC 成熟，而不仅仅是维持 Foxn1 的表达 。无监督单细胞分析结果，验证了 mTOs 作为研究胸腺生物学和进行中高通量筛选的生理相关平台的可行性。
mTOs 平台的局限性及改进方向
尽管 mTOs 平台取得了重要进展，但仍存在一些局限性。mTO 系统虽能有效支持 DN 细胞分化为双阳性（DP）细胞，并最终分化为成熟的 CD4+（SP4）和 CD8+（SP8）T 细胞，但细胞数量在培养第 7 天左右达到峰值，包括 DN、DP 和早期成熟的单阳性（SP）细胞。值得注意的是，在培养第 7 天到第 14 天之间，胸腺细胞数量会急剧减少，DP 群体尤为明显，SP 细胞也有较明显的下降 。此外，Aire+成熟 mTECII 群体在类器官中的比例较低，这可能是由于其成熟所需的 DP 胸腺细胞数量不足 。这些局限性可能与 mTO 平台的微型化尺寸有关，有限的龛位大小和资源，难以满足胸腺细胞长期存活、分化和扩增的需求。培养 7 天后，mTOs 可能达到最大承载能力，出现 “耗尽” 现象。未来可以通过补充生长因子、细胞因子、改善氧合条件，或调整类器官的大小和组成等方法，来解决这些问题，提高 mTOs 的长期功能性。
mTOs 平台的应用前景
总体而言，Major 等人开发的基于微孔阵列的 mTO 模型，为胸腺基质建模提供了可扩展、可重复且高通量的平台。该系统还能够对类器官形成和胸腺细胞 - 基质相互作用进行实时动态成像，为研究 T 细胞发育的动力学提供了前所未有的视角。
近期两项研究在建立胸腺上皮类器官（TEOs）方面取得了关键技术进展。Hübscher 等人证明了胎儿 TEC 祖细胞来源的 TEOs，能够支持 cTEC 和 mTEC 的分化，在体外部分重现了胸腺结构 。Lim 等人成功开发了一种方案，可从成年胸腺中分离出双潜能 TEC 祖细胞，这些祖细胞在体外可扩增超过 2 年 。这两项研究均表明，将 TEOs 移植到无胸腺裸鼠体内，能够形成类似胸腺的结构，并介导功能性 T 细胞成熟，包括生成 CD4+和 CD8+ T 细胞。结合这些在 TEC 祖细胞扩增和 TEO 生成方面的技术进步，mTO 系统有望成为进一步研究胸腺基质生物学和 T 细胞发育过程中淋巴 - 基质相互作用的通用平台。
将 mTO 平台应用于人类 TEC 和基质细胞（包括原代细胞和诱导多能干细胞来源的细胞），有助于模拟人类胸腺的各种功能龛位，为筛选促进胸腺功能或再生的治疗药物提供有力工具，在未来的医学研究和临床应用中具有巨大的潜力。
