乙肝病毒核心蛋白变异体 CpF97L：改写乙肝病毒研究格局，助力攻克乙肝难题

《Journal of Virology》：The HBV variant CpF97L supports the secretion of pgRNA-containing virions at a level much greater than WT HBV

这篇研究聚焦乙肝病毒（HBV）。自然发生的核心蛋白变异体 CpF97L 不同寻常，它能分泌高水平含单链 DNA（ssDNA）和前基因组 RNA（pgRNA）的病毒粒子，且分泌特性与细胞系无关。该发现为研究 HBV 复制及治疗提供了新视角，极具科研价值。

　　### 乙肝病毒核心蛋白变异体 CpF97L 研究

引言

慢性乙肝病毒（HBV）感染是全球性公共卫生威胁，每年新增大量感染者和死亡病例。HBV 属于嗜肝 DNA 病毒科，其病毒粒子通过肝细胞上的钠 - 牛磺胆酸共转运多肽（NTCP）受体进入细胞，释放双链 DNA（dsDNA）基因组。在细胞核内，dsDNA 转变为共价闭合环状 DNA（cccDNA），作为转录模板。其中，前基因组 RNA（pgRNA）具有多种功能，它既是核心蛋白（Cp）和聚合酶（P）的信使 RNA，也是逆转录模板。通常，含 dsDNA 的衣壳优先分泌为包膜病毒粒子，而含 pgRNA 或单链 DNA（ssDNA）的衣壳留在细胞质中成熟为 dsDNA。但患者中常见的 Cp 突变（如 CpF97L 或 CpI97L）会导致细胞培养实验中分泌高水平含 ssDNA 的病毒粒子。本研究发现，HBV - CpF97L 还能分泌高水平含 RNA 的病毒粒子。

结果

1. 抑制 DNA 合成时，CpF97L 分泌高水平含 pgRNA 的病毒粒子：通过两种方法抑制 DNA 合成，即使用核苷类似物恩替卡韦（ETV）和引入 Y63F 突变。实验表明，转染相关质粒的细胞经处理后，DNA 合成受抑制，RNA - 衣壳在细胞内积累。在含 CpF97L 突变的样本中，能检测到大量含 pgRNA 的病毒粒子分泌，而野生型（WT）样本分泌的 RNA 病毒粒子水平较低。
2. CpF97L^{RT -}分泌 RNA 病毒粒子水平与 dsDNA 相当，WT^{RT -}则不然：使用 WT^{RT -}和 CpF97L^{RT -}质粒生成 RNA 衣壳和病毒粒子，经检测发现，两者细胞内积累的含 RNA 衣壳数量相似，但 CpF97L^{RT -}分泌的含 pgRNA 病毒粒子水平较高，与合成 dsDNA 病毒粒子的 WT 相当，约为 WT^{RT -}的八倍。
3. RNA 病毒粒子分泌与细胞系无关：此前实验使用 Huh7 细胞系，为确定分泌特性是否依赖细胞系，用 HepG2 细胞系转染 CpF97L^{RT -}。结果显示，HepG2 细胞也能产生含 RNA 的病毒粒子，表明这是 CpF97L 的固有属性。
4. RNA 和 dsDNA 病毒粒子分泌动力学相似：转染 WT 或 CpF97L^{RT -}质粒，收集不同时间点的培养基检测病毒粒子水平。发现两者病毒粒子积累模式相似，说明 CpF97L 突变不改变病毒粒子分泌动力学。
5. CpF97L^{RT -}病毒粒子中的 RNA 长度约为 3,500 nt：通过免疫沉淀（IP）纯化病毒粒子、提取 RNA 并进行 Northern blotting 分析。结果显示，病毒粒子中的 RNA 包括 pgRNA、剪接的 pgRNA 和其他 HBV RNA，且全长 pgRNA 只占总包装 RNA 的一小部分。
6. 逆转录活跃时，CpF97L 分泌含 pgRNA 的病毒粒子：在逆转录活跃且分泌 DNA 病毒粒子的情况下，检测发现 CpF97L 病毒粒子中存在 pgRNA，而 WT 病毒粒子中未检测到全长 pgRNA。
7. CpF97L 病毒粒子中 dsDNA、ssDNA 和 pgRNA 的比例：通过粒子印迹和顺序探针杂交，确定了 CpF97L 病毒粒子中各类核酸的比例。与 WT 相比，CpF97L 分泌更多含 ssDNA 和 RNA 的病毒粒子。

讨论

本研究发现，HBV CpF97L 分泌含 pgRNA 病毒粒子的水平远高于 WT HBV。RNA 病毒粒子分泌不是细胞系特异性的，且 RNA 和 DNA 病毒粒子分泌动力学相似，这暗示存在其他影响病毒粒子分泌的机制。病毒粒子中的 HBV RNA 包含多种类型，其作用有待研究。此外，CpF97L 能分泌多种类型的未成熟病毒粒子，但氨基酸 97 与包膜和病毒粒子形态发生的关系尚不明确。由于难以分离纯化不同基因组的病毒粒子，目前对含 pgRNA 或 ssDNA 病毒粒子的感染性了解有限。不过，CpF97L 可作为研究工具，助力探索 pgRNA 病毒粒子在 HBV 生物学中的作用。同时，使用血清中 RNA 病毒粒子作为 cccDNA 储存库的替代标志物可能存在误导，应谨慎解读相关数据。未来需要新的治疗方法，如联合使用逆转录酶抑制剂和衣壳组装调节剂，以有效阻断 cccDNA 的建立、pgRNA 的包装、DNA 合成和病毒粒子分泌，攻克乙肝难题。