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《Nanoparticle-based biosensor integrated with multiple cross-displacement amplification for visual and rapid identification of hepatitis B virus and hepatitis C virus》一文，将等温多重交叉置换扩增（MCDA）与金纳米颗粒侧向流动生物传感器（AuNPs-LFB）相结合，开发出可同时准确、灵敏、快速、低成本且可视化检测乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）的新方法，极具应用潜力。
### 乙肝和丙肝病毒感染现状与检测需求
乙肝病毒（HBV）和丙肝病毒（HCV）感染严重威胁人类健康，全球感染人数众多，在低收入和中等收入地区问题尤为突出。世界卫生组织（WHO）提出到 2030 年消除病毒性肝炎的目标，但 HBV/HCV 的低诊断率成为实现该目标的重大挑战。目前临床常用的实验室免疫测定和核酸扩增检测（NAATs）存在诸多局限性，如免疫测定不适用于急性感染诊断且可能出现假阴性，NAATs 成本高、耗时久，在资源有限地区难以开展。因此，开发一种经济、灵敏、特异、快速、无需设备且操作简便的即时诊断（POC）平台至关重要。
HBV&HCV-MCDA-AuNPs-LFB 检测方法的建立
- 原理：该检测方法整合了等温多重交叉置换扩增（MCDA）和金纳米颗粒侧向流动生物传感器（AuNPs-LFB）技术。MCDA 基于链置换 DNA 合成和自动循环，能在等温条件下快速扩增特定核酸序列。AuNPs-LFB 则利用生物分子结合和毛细管作用，实现检测结果的可视化。
- 引物设计：针对中国主要的 HBV 基因型（B、C、D、B/C 重组和 C/D 重组）的 S 基因和 HCV 亚型（1b、2a、3a、3b 和 6a）的 5′非翻译区（5′-UTR）基因，设计了两组独特的 MCDA 简并引物。引物经 DNASTAR 软件比对和 NCBI BLAST 工具验证，确保特异性。
- 生物传感器制备：AuNPs-LFB 由样本垫、结合垫、硝酸纤维素（NC）膜和吸收垫组成，在 NC 膜上分别喷涂抗 FAM、抗地高辛和生物素化牛血清白蛋白（biotin-BSA），用于检测 HBV-MCDA、HCV-MCDA 扩增产物和作为色谱对照。
检测方法的性能优化与验证
- 可行性验证：以 HBV 和 HCV 标准质粒、甲型肝炎病毒（HAV）和人类免疫缺陷病毒（HIV）的病毒 RNA 为模板，进行 MCDA 反应，通过琼脂糖凝胶电泳、比色指示剂（孔雀石绿，MG）和 AuNPs-LFB 分析，结果表明所设计的引物能有效扩增目标基因，且该方法可同时检测 HBV 和 HCV。
- 反应条件优化：通过实时浊度监测，确定 MCDA 反应的最佳温度为 64°C。在此温度下，进一步优化反应时间，结果显示 35 分钟时可准确检测到低至 10 拷贝的目标基因，确定为最佳反应时间。
- 灵敏度分析：以系列稀释的 HBV 基因型 B 的 S 质粒和 HCV 亚型 1b 的 5′-UTR 质粒为模板，该检测方法的检测限（LoD）为 10 拷贝 / 测试，且能同时检测 HBV 和 HCV，灵敏度与单病毒检测相当。
- 特异性分析：使用 HBV 和 HCV 质粒、临床样本及 13 种其他病原体及其混合物进行检测，结果显示该检测方法对 HBV 和 HCV 的特异性为 100%，无交叉反应。
- 临床样本可行性验证：对 107 份疑似 HBV 和 / 或 HCV 感染患者的血清样本进行检测，与实时 PCR 检测结果相比，该检测方法对 HBV 和 HCV 检测的灵敏度和特异性均为 100%，表明可用于临床 HBV 和 HCV 感染的检测。
讨论
- 优势：HBV&HCV-MCDA-AuNPs-LFB 检测平台实现了单一检测中对 HBV 和 HCV 感染的高度准确、灵敏、快速、简便、经济和可视化诊断。整个检测过程可在 50 分钟内完成，包括快速核酸提取（约 10 分钟）、MCDA 反应（35 分钟）和 AuNPs-LFB 判读（小于 2 分钟）。该方法使用的 Bst DNA 聚合酶对粗核酸的耐受性强，且 MCDA 反应可在简单设备上进行等温扩增。
- 与其他技术比较：与其他等温扩增技术如重组酶聚合酶扩增（RPA）和环介导等温扩增（LAMP）相比，本研究的方法能同时检测 HBV 和 HCV，且检测限低至 10 拷贝 / 测试，检测时间更短。
- 局限性：HBV 和 HCV-MCDA 引物仅能特异性识别中国的优势基因型，由于病毒的高遗传异质性，引物需进一步改进。此外，使用 AuNPs-LFB 分析 MCDA 结果时需打开反应管，增加了交叉污染的风险。
综上所述，HBV&HCV-MCDA-AuNPs-LFB 检测方法具有良好的应用前景，尤其适用于低收入和中等收入地区的 HBV 和 HCV 感染诊断，但仍需针对局限性进行改进和完善。
