PPP1R3C：连接软骨细胞与肿瘤中胆固醇代谢和异柠檬酸脱氢酶的关键枢纽

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Protein Phosphatase 1 Regulatory Subunit 3C integrates cholesterol metabolism and isocitrate dehydrogenase in chondrocytes and neoplasia

本文聚焦于软骨瘤相关研究，发现蛋白磷酸酶 1 调节亚基 3C（PPP1R3C）在 IDH 突变的软骨细胞中高表达，它整合胆固醇代谢与异柠檬酸脱氢酶（IDH），调控细胞内糖原水平，影响肿瘤表型，为 IDH 突变肿瘤治疗提供新思路。

　　

研究背景

软骨瘤是常见的骨肿瘤，由生长板细胞来源的软骨细胞组成，可进展为恶性软骨肉瘤。异柠檬酸脱氢酶（IDH1 和 IDH2）基因突变在这类肿瘤中较为常见。IDH 酶参与柠檬酸循环，正常情况下将异柠檬酸转化为 α- 酮戊二酸（α-KG），而突变的 IDH 酶产生 2 - 羟基戊二酸（D2-HG），具有重要的表观遗传效应，影响肿瘤发生、细胞维持和生长。此前研究表明，IDH 突变的软骨细胞中细胞内胆固醇和糖原上调。蛋白磷酸酶 1 调节亚基 3C（PPP1R3C，曾称糖原靶向蛋白 PTG）可调节糖原生物合成，且在某些癌细胞系中表达存在差异，可能在肿瘤发生中发挥作用。本研究旨在探究 PPP1R3C 在软骨细胞糖原积累中的作用，以及其受细胞内胆固醇生物合成相关基因的调控机制。

研究结果

1. IDH 突变增加生长板软骨细胞和软骨肉瘤中 PPP1R3C 的表达：通过构建条件性突变的 IDH1（IDH1^R132C）和 IDH2（IDH2^R172S）转基因小鼠，并与 Col2a1Cre 转基因小鼠杂交，激活突变 IDH 在软骨细胞中的表达。结果显示，IDH 突变的生长板软骨细胞中 D2-HG 水平显著升高，出现与其他 IDH 突变小鼠相似的胎儿表型，包括生长板软骨扩张、X 型胶原（Col X）产生的软骨细胞增多、围产期致死率增加和侏儒症等，3 个月时出现软骨瘤样病变。通过原位杂交、蛋白免疫印迹等实验发现，IDH 突变显著增加了生长板软骨细胞中 Ppp1r3c 的表达，尤其是在增殖期和前肥大期软骨细胞中。在患者来源的原发性软骨肉瘤细胞中，PPP1R3C 表达也较高。用多西环素（Dox）诱导 IDH1 或 IDH2 突变体过表达，可使 PPP1R3C 和糖原水平增加，而 IDH1 突变体抑制剂 AG-120 则降低 PPP1R3C 表达。
2. 删除 Ppp1r3c 部分挽救由突变 IDH1 或 IDH2 引起的生长板表型：将 Ppp1r3c^fl/fl小鼠与 Col2a1Cre、Col2a1Cre;R26^IDH1R132C和 Col2a1Cre;R26^IDH2R172S动物杂交，条件性删除软骨细胞中的 Ppp1r3c。结果显示，删除 Ppp1r3c 可降低 IDH 突变动物增殖期和前肥大期软骨细胞中糖原积累，减少 Col X 染色面积，改善肢体长度和软骨与骨的比例。在 4 周龄时，删除 Ppp1r3c 部分挽救了由突变 IDH1/2 引起的侏儒症，改善了胸骨柄和骺板的二次骨化延迟，促进了近端胫骨骨骺二次骨化中心（SOC）的形成，部分恢复了近端胫骨生长板的柱状结构。6 个月时，删除 Ppp1r3c 减少了 IDH 突变小鼠软骨瘤样病变的大小和数量。
3. PPP1R3C 介导 IDH 突变软骨肉瘤的肿瘤生长：在 IDH 突变的软骨肉瘤细胞系 JJ012 中，构建 Dox 诱导的 PPP1R3C 过表达细胞系和 PPP1R3C 敲除细胞系。结果表明，细胞内糖原水平和细胞活力与 PPP1R3C 表达水平相关，PPP1R3C 过表达增加糖酵解和糖酵解能力，而基因缺失则显著损害这些能力。将 Dox 诱导的针对 PPP1R3C 的短发夹 RNA（shRNA）质粒转染到携带 IDH1 突变的原发性软骨肉瘤细胞中，敲低 PPP1R3C 可显著抑制肿瘤进展，降低肿瘤重量，减少肿瘤细胞增殖（Ki67 阳性细胞减少）。RNA 测序分析发现，PPP1R3C 过表达增加了参与代谢途径的基因表达，而敲低则调节了与细胞粘附和增殖相关的基因。重新分析人类软骨肉瘤队列数据发现，低 PPP1R3C 表达的患者 5 年生存率有 18% 的优势。
4. SREBF2 调节软骨细胞和软骨肉瘤中的 PPP1R3C：分析 Ppp1r3c 小鼠启动子序列，发现多个固醇调节元件结合因子（SREBF）结合位点，且在其他人类细胞类型的 SREBF2 公共染色质免疫沉淀测序（ChIP-seq）数据库中也找到 SREBF2 在 PPP1R3C 启动子区域的结合位点。ChIP-qPCR 显示，SREBF2 在软骨肉瘤细胞系中被招募到 PPP1R3C 启动子区域。构建 Dox 诱导的 HA-SREBF2 过表达软骨肉瘤细胞，发现过表达 SREBF2 增加胆固醇水平，增强胆固醇途径靶基因（如 LDLR 和 HMGCR）的表达，同时促进 PPP1R3C 表达。ChIP-seq 分析证实 SREBF2 直接结合到 PPP1R3C 启动子区域。用洛伐他汀（Lovastatin）处理软骨肉瘤细胞，虽抑制细胞活力，但由于反馈机制使 SREBF2 表达升高，进而增加 PPP1R3C 表达，且 SREBF2 在 PPP1R3C 启动子区域的招募增多。
5. PPP1R3C 部分挽救由细胞内胆固醇生物合成缺乏引起的异常软骨分化：研究先前构建的细胞内胆固醇生物合成受抑制的小鼠（Col2a1Cre;Scap^fl/fl），发现其有严重侏儒症、异位肥大细胞和围产期致死性，生长板增殖区柱状结构破坏，肥大软骨细胞数量减少。而 Col2a1Cre;Ppp1r3c^OE;Scap^fl/fl胚胎部分恢复了柱状结构，增加了肥大软骨细胞数量，提高了胫骨中骨与软骨的比例，Ppp1r3c 过表达还增加了糖原积累。在 ATDC5 细胞中，用 Dox 诱导 shRNA 靶向 Scap，同时过表达 PPP1R3C，发现 Scap 敲低减少蛋白聚糖产生（Alcian blue 染色阳性区域和强度降低），而 PPP1R3C 过表达部分恢复了这一现象，且增加了软骨形成相关基因（如 Sox9、Col2a1、Aggrecan 和 Col10a1）的表达。在软骨肉瘤细胞中，敲低 SCAP 抑制细胞生长，而 PPP1R3C 过表达可克服这种抑制作用。用 Fatostatin（SCAP 和 SREBF 转录活性抑制剂）处理细胞，降低 PPP1R3C 表达和细胞活力，而 PPP1R3C 过表达可部分逆转这种影响。洛伐他汀抑制胆固醇合成，通过反馈上调 SREBF 转录活性和 PPP1R3C 表达；而 Fatostatin 直接抑制 PPP1R3C 表达。联合使用 Fatostatin 和 AG-120（突变 IDH 靶向药物）对细胞活力有协同抑制作用，而洛伐他汀与 AG-120 联合使用则有相反效果。

研究讨论

本研究表明，PPP1R3C 介导生长板软骨细胞中的糖原积累，在 IDH 突变的软骨细胞中表达升高，且受 SREBF 调节，这一机制连接了细胞内胆固醇生物合成和糖原积累，可能在多种 SREBF 转录活跃的情况下发挥作用。新构建的两种 Idh 突变小鼠表型相似，说明细胞质和线粒体中的突变异柠檬酸脱氢酶在代谢调节中功能相似。生长板软骨细胞中糖原的功能在生理条件下可能存在其他能量来源的补偿机制，Ppp1r3c 缺失实验结果与之相符。胆固醇生物合成相关基因对 Ppp1r3c 的调节，解释了补充外源性胆固醇不能挽救细胞内胆固醇生物合成缺乏的软骨细胞表型的原因。洛伐他汀治疗软骨肉瘤存在局限性，因其会增加 PPP1R3C 表达，无法靶向细胞内糖原，而 Fatostatin 可直接抑制 PPP1R3C 表达。PPP1R3C 在一些肿瘤类型中差异表达，靶向糖原可能成为一种治疗方法，调节 SREBF 活性以下调 PPP1R3C 表达是一种潜在的治疗策略。