碳青霉烯类抗生素耐药机制新突破：铜绿假单胞菌 OprD 蛋白的关键作用

为解决碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）耐药机制复杂的问题，研究人员开展对仅碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CROPA）的研究。结果发现 CROPA 的出现与 OprD 变化直接相关，恢复 OprD 表达可增强其对碳青霉烯类敏感性，文章发表在《BMC Microbiology》为临床治疗和新药研发提供理论基础。

　　

在医院这个 “病菌战场” 上，铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）可谓是一名 “难缠的对手”，它是常见的机会致病菌，尤其爱 “攻击” 免疫功能低下的人群，像慢性阻塞性肺疾病、囊性纤维化、癌症患者，还有伤口感染、烧伤、败血症以及使用呼吸机的肺炎患者，甚至感染新冠病毒（COVID-19）的患者都容易 “中招”。传统抗生素治疗是对抗它的常用手段，碳青霉烯类抗生素凭借强大的抗菌活性、良好的酶稳定性和较少的副作用，成为治疗严重感染的 “主力军”，在对抗铜绿假单胞菌感染时发挥着重要作用。

然而，随着时间推移，耐药问题日益严重。碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CRPA）逐渐出现，且这类细菌对其他抗生素的耐受性也更高，给治疗带来极大挑战。目前针对多药耐药的 CRPA（MDR-CRPA）研究发现了多种耐药机制，可这些机制过于复杂，涉及众多基因突变和调控机制，难以明确导致碳青霉烯耐药的关键因素。

在这样的背景下，山东第一医科大学附属中心医院的研究人员决心深入探索。他们发现了一种特殊的菌株 —— 仅碳青霉烯耐药铜绿假单胞菌（CROPA），这类菌株只对碳青霉烯类抗生素耐药，对其他测试的抗铜绿假单胞菌抗生素却敏感。于是，研究人员针对 CROPA 展开研究，试图揭开其耐药机制的神秘面纱。该研究成果发表在《BMC Microbiology》上。

研究人员采用了多种关键技术方法。首先，从山东省某三甲医院收集 2021 - 2023 年的临床样本，通过细菌分离鉴定和抗菌药敏试验筛选出 CROPA 菌株。接着，利用全基因组测序技术分析菌株基因，进行多基因序列分型（MLST）；运用实时定量 PCR（RT-qPCR）检测相关基因表达；构建基因敲除和互补菌株，进一步探究基因功能。

下面来看看具体的研究结果。

1. CROPA 的抗菌药敏特征和序列型（STs）：研究人员在 2021 - 2023 年从医院收集到 11921 份临床细菌分离株，其中有 1424 份是铜绿假单胞菌。对这些铜绿假单胞菌进行药敏测试后发现，它们对常用抗生素的耐药情况不容乐观，对碳青霉烯类抗生素（如亚胺培南、美罗培南）的耐药率接近 30%。在 492 株 CRPA 中，仅有 11 株（2.2%）是 CROPA。对 CROPA 菌株进行基因组扫描和 MLST 分析后发现，11 株 CROPA 临床分离株之间关系紧密，部分菌株与全球流行的高毒力耐药菌株有一定的亲缘关系，且只有 CROPA - 02 携带与高毒力相关的 exoU 基因。

2. CROPA 中不存在碳青霉烯酶和外排泵过表达：研究人员通过对已知碳青霉烯酶基因的检测，发现 CROPA 菌株中不存在常见的碳青霉烯酶（如 bla_VIM、bla_IMP 、bla_{KPC - 2}、bla_{OXA - 48}、bla_{NDM - 1}）。同时，利用 RT-qPCR 检测外排泵相关基因 mexA、mexC、mexE 和 mexX 的表达，虽然外排泵转录因子存在一些突变，但未观察到外排泵的过表达。这表明在铜绿假单胞菌中，碳青霉烯耐药的产生不一定依赖外排泵的过表达。

3. CROPA 中 OprD 表达降低或提前终止：研究人员以对所有临床检测抗生素敏感的 PAO1 菌株为参考基因组，对 11 株 CROPA 菌株的 oprD 基因进行突变位点分析，发现所有 CROPA 菌株的 oprD 基因都存在突变。部分菌株出现氨基酸突变，还有 8 株菌株出现 oprD 基因表达提前终止的情况，甚至在 CROPA - 01 中发现 IS256 元件插入 oprD 基因。通过 qPCR 检测发现，7 株 CROPA 菌株中 OprD 的转录水平大幅下降。提取外膜蛋白进行 SDS - PAGE 分析也证实了 CROPA 中 OprD 表达减少。

4. 野生型 OprD 过表达使 CROPA 对亚胺培南敏感：研究人员构建了 oprD 敲除菌株，结果显示敲除 OprD 后，亚胺培南的最低抑菌浓度（MIC）从 2mg/L 增加到 32mg/L，美罗培南的 MIC 从 1mg/L 增加到 4mg/L，表明敲除 OprD 增强了菌株的耐药性。而将野生型 oprD 基因导入 CROPA 菌株后，CROPA 菌株对亚胺培南和美罗培南的 MIC 显著降低，敏感性增强。这说明野生型 OprD 的存在确实能使铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素更敏感。

5. CROPA 与 MDR - CRPA 耐药机制的比较：研究发现，100% 的 CROPA 菌株存在 OprD 突变或功能丧失，且其氨基酸突变涵盖了 MDR - CRPA 中 OprD 的所有突变类型。与 MDR - CRPA 不同的是，CROPA 菌株不产生碳青霉烯酶，也没有高表达的外排泵。虽然 CROPA 菌株外排泵转录因子存在一些突变，但这些突变并未导致外排泵转录上调。

综合研究结果和讨论部分，该研究明确了 OprD 功能丧失是 CROPA 对碳青霉烯类抗生素耐药的核心机制，这一发现具有重要意义。一方面，它为临床治疗 CROPA 感染提供了精准的用药依据，医生可以根据这一特性选择有效的抗生素，避免过度使用广谱抗生素。另一方面，为开发新型抗感染药物指明了方向，未来可以针对 OprD 靶点研发更具针对性的药物，提高治疗效果。不过，研究也存在一定局限性，样本量较小，且不能完全排除未知耐药因素的影响。但总体而言，这项研究为解决碳青霉烯耐药问题提供了新的思路和理论基础，在抗菌药物研发和临床治疗领域具有重要的参考价值。