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这篇系统综述聚焦口腔鳞状细胞癌（OSCC），通过 16S 核糖体 RNA 测序，对比肿瘤组织（TT）和非肿瘤组织（NT）的细菌丰度与多样性。研究发现两者细菌组成差异显著，为探索细菌在 OSCC 发病机制中的作用提供依据，对口腔癌诊疗研究意义重大。
口腔鳞状细胞癌（OSCC）研究背景
口腔癌在全球癌症发病率中位列第六，2020 年有 377,713 例新发病例和 177,757 例死亡病例，且新发病例数较 2018 年有所增加。其中，超过 90% 的口腔癌为口腔鳞状细胞癌（OSCC） 。传统上，OSCC 多发生于老年人，但近年来在年轻群体中的发病率呈上升趋势。
OSCC 的发病机制复杂，是多因素共同作用的结果。长期以来，烟草使用和（或）饮酒被视为重要的临床风险因素。然而，近年来在无烟草和（或）酒精使用习惯的患者中，OSCC 的发病率也显著上升，这促使人们探索口腔致癌的其他潜在风险因素，口腔微生物组便是其中之一。
人体口腔微生物组是最为多样的微生物群落之一，包含来自舌头、颊黏膜和唾液等不同部位的 700 多种细菌。众多研究表明，口腔癌患者存在细菌群落失调现象，这可能与致癌过程相关。不过，目前对于 OSCC 患者与健康个体口腔细菌群落的差异，在细菌丰度和多样性方面尚未达成明确共识。此前虽有系统综述探讨过该问题，但存在诸多不足，如未区分不同口腔亚部位的细菌群落来源，未针对特定细菌鉴定技术进行评估等。因此，本研究聚焦于通过 16S 核糖体 RNA 测序，对比 OSCC 肿瘤组织和非肿瘤组织的细菌群落，旨在更精确地探究与口腔癌相关的细菌群落特征。
研究方法
本系统综述严格遵循系统评价和荟萃分析的首选报告项目（PRISMA）指南进行，确保研究的透明度和可重复性，且研究方案已在国际系统评价前瞻性注册平台（PROSPERO）注册，注册号为 CRD42023458745。
研究问题聚焦于评估 OSCC 肿瘤组织（TT）与同一患者的非肿瘤相邻健康组织或其他患者的健康组织（NT）之间，细菌丰度和多样性是否存在差异。研究主要关注通过 16S 核糖体 RNA 测序，对比 TT 和 NT 细菌群落的观察性横断面研究，以评估两组间细菌丰度和多样性的差异。其中，细菌丰度通过两组组织中普遍存在的物种、属或门等指标衡量，细菌多样性则通过 Chao1、观察丰富度、Good's Coverage、Simpson、Shannon 等 α 多样性指数，以及 Bray-Curtis、Jaccard 指数等 β 多样性指数来表达。
搜索策略基于 PECO 标准制定，在 PUBMED 和 SCOPUS 数据库中使用关键词和医学主题词（MeSH）进行检索。同时，查阅先前系统综述的参考文献以及 OpenGrey 等灰色文献数据库，以获取相关研究。检索限定为截至 2024 年 8 月 31 日发表的英文文献。
研究的纳入标准为：通过 16S 核糖体 RNA 测序，对比 OSCC 肿瘤组织与非肿瘤健康口腔组织细菌群落的观察性人体研究。排除标准包括：对比肿瘤组织与潜在恶性疾病组织的研究；肿瘤组织接受过放射治疗的研究；从口腔冲洗液、拭子或唾液标本中鉴定细菌群落的研究；通过刷检收集上皮细胞鉴定细菌群落的研究；仅通过免疫组化分析鉴定细菌的研究；以及从二次数据库获取细菌群落数据的研究。
采用纽卡斯尔 - 渥太华量表（NOS）的三个标准和 8 个根据细菌群落研究特殊需求定制的标准，对纳入研究的质量进行评估。NOS 标准主要评估 TT 和 NT 的选择、可比性以及结果三个方面，满分为 9 分。定制标准涵盖研究问题的明确性、样本采集过程中的潜在污染、16S 核糖体基因靶向区域、测序深度、用于减少测序误差的生物信息学软件、分类数据库分配的准确性、肿瘤组织的组织病理学评估以及组织部位的异质性等方面，每项标准满足得 1 分，不满足得 0 分，满分 8 分。总质量评分最高为 17 分，得分至少 12 分的研究被认定为高质量研究。
从选定的研究中，使用 Microsoft Excel（2019 版本）系统记录数据。提取的数据包括作者和发表年份、样本类型（TT 作为病例，NT 作为对照，对照组织来源为癌旁组织、同一患者的对侧黏膜或不同患者的健康组织）、样本大小、年龄、性别比、肿瘤部位、临床分期、分级、习惯史（如烟草或酒精使用情况）、DNA 提取试剂盒、PCR 靶向区域、16S 核糖体 RNA 测序技术、生物信息学软件、测序深度、用于分类鉴定的参考数据库，以及 TT 和 NT 在物种、属、门水平的相对和专属细菌丰度，还有通过 α 和 β 多样性指数表示的细菌多样性。在确定细菌属于 TT 还是 NT 时，仅考虑两组间丰度差异至少 10% 或具有统计学显著差异（p<0.05）的细菌，将其认定为相对丰度较高的细菌；仅在一组中出现的细菌则被记录为专属丰度较高的细菌。若文章中提及物种水平的分类信息，则根据 NCBI 数据库确定其完整分类谱系并报告。
由于各研究在 α 和 β 多样性指标的报告上存在显著异质性，不适合进行荟萃分析，因此对纳入文章进行定性评估，以分析 TT 和 NT 中的细菌丰度和多样性。
研究结果
通过数据库检索，最初共识别出 223 篇文章，去除重复和不相关研究后，剩余 118 篇。经标题和摘要筛选，排除 47 篇，另有 5 篇文章无法获取。对 66 篇符合初步筛选标准的文章进行资格评估，排除 47 篇，最终对 19 篇文章进行全文阅读筛选。因多种原因，如对比 TT 与癌前组织、样本为口腔拭子和细胞学标本的细菌群落、通过免疫组化检测细菌蛋白表达、肿瘤组织接受过放疗以及细菌群落数据来自二次数据库等，排除 6 篇文章，最终 13 篇文章符合纳入标准，被纳入本系统综述。
研究涉及的人群地理分布广泛，涵盖中国、英国、斯里兰卡、沙特阿拉伯、美国（纽约、费城）、西班牙、印度等地。各研究的样本量不同，每个研究中肿瘤组织（TT）和正常组织（NT）的数量在 10 - 65 之间，13 项研究共提供了 374 个 TT 样本和 341 个 NT 样本。患者年龄在不同研究中的呈现方式各异，部分研究报告为平均值，部分为中位数，还有些以平均值 ± 标准差表示，TT 组年龄范围为 49.3±13.24 至 63.0±9.6，NT 组为 50.67±6.81 至 63.0±9.6。多数研究报告男性口腔癌患病率高于女性，且在 TT 和 NT 组中匹配了性别比例。部分研究提及口腔黏膜的亚部位、患者的吸烟、饮酒和鼻烟使用习惯，以及肿瘤的分期和分级情况。
TT 和 NT 的样本采集方式在各研究中存在差异。TT 通常取自肿瘤部位，仅有一项研究分别采集了浅表和深部肿瘤组织样本。NT 则多取自癌旁部位或不同患者的健康黏膜，也有研究对比了 OSCC 与同一解剖部位纤维上皮息肉的细菌群落。部分研究记录了癌旁黏膜采集的 TT 和 NT 之间的距离，范围在 2 - 5cm，多数研究报告了活检组织的大小、质量或体积。
在实验技术方面，除一项研究采用改良的 DNA 提取方法外，其余研究均使用商业 DNA 提取试剂盒。DNA 扩增靶向细菌 16S 核糖体基因的单个或多个高变区，不同研究靶向区域不同，包括 V4、V1 - V3、V3 - V4、V4 - V5 等。多数研究采用 Illumina MiSeq 系统进行测序，也有研究使用 Illumina PE250、Illumina HiSeq 2500 平台、ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer、ABI PRISM 3730xl 等技术，还有研究使用 NEB Next rRNA Depletion Kits E7850 & E7400 以及 QiiME 测序平台。在分类鉴定时，使用了 GenBank、KEGG、Silva、RDP、HOMD、UNITE 5.8s 等多种参考数据库，部分研究未明确提及参考数据库。
在细菌丰度方面，多数研究在物种、属和门水平报告了细菌群落数据。在物种水平，共鉴定出 TT 中 10 种、NT 中 11 种专属丰度较高的物种，仅有 5 种常见物种在 TT 和 NT 中均存在。在属水平，TT 和 NT 分别有 7 个和 6 个专属属，同时有 7 个常见属。在门水平，除 Chloroflexota、Deinococcus - Thermus 和 Mycoplasmatota 仅在 TT 中发现外，还鉴定出多个与 TT 和 NT 相关的门。此外，TT 中相对丰度较高的有 54 种物种、35 个属和 12 个门，NT 中相对丰度较高的有 45 种物种、32 个属和 7 个门。
多数研究评估了细菌多样性，使用的指标包括 Shannon、Simpson、Chao 指数等 α 多样性指数，以及 Bray - Curtis、Jaccard 指数等 β 多样性指数。不同研究中，α 多样性指数结果差异较大。例如，Chao 指数在不同研究中，有的显示 TT 中较高，有的显示 NT 中较高；Shannon 指数和 Simpson 指数在不同研究中的结果也不一致，反映出微生物多样性模式受患者特征、样本大小和样本采集方法等多种因素影响。在 β 多样性方面，仅有 5 项研究报告了相关数据，且对 TT 和 NT 之间的差异描述不充分。
质量评估结果显示，多数纳入研究的得分至少为 12/17，部分研究得分达到 14 分及以上，甚至有一项研究获得满分 17/17。这表明多数研究在方法学严谨性和报告质量方面表现良好，但仍有部分研究在非肿瘤组织（NT）的组织病理学评估、组织部位异质性以及测序深度等方面存在不足，有待改进。
讨论
本研究首次通过 16S 核糖体 RNA 测序，对比了 OSCC 肿瘤组织（TT）和健康 / 癌旁组织（NT）的细菌群落丰度和多样性，在物种、属和门水平确定了专属细菌丰度。研究人群地理分布广泛，这虽增强了结果的普遍性，但也因不同人群细菌群落的差异，凸显了控制区域影响的必要性。
NT 中存在如大肠杆菌（Escherichia coli）、假单胞菌（Pseudomonas beteli）等机会性病原体，这可能与口腔微生物群落的动态生态、宿主免疫系统、细菌的亚临床状态以及抗生素使用有关。在正常情况下，这些病原体与正常共生菌保持平衡，不会引发疾病。
在属水平上，TT 中存在 7 个专属属，且有 35 个属相对丰度较高。与先前的系统综述相比，本研究发现了一些新的属，同时也有部分属在本研究中未被检测到，这可能是由于样本类型不同，本研究仅关注组织特异性细菌丰度。
在物种水平上，TT 中存在 10 种专属细菌，还有 20 种细菌在先前的系统综述中未被报道，这可能归因于本研究样本为 OSCC 患者的肿瘤组织，具有组织特异性。同时，不同 Prevotella 属的物种在 TT 和 NT 中的分布存在差异，表明同一属内不同物种的细菌行为可能有显著差异。
在门水平上，除 Chloroflexota、Deinococcus - Thermus 和 Mycoplasmatota 仅在 TT 中发现外，两组间无显著差异。这些门在先前的系统综述中未被报道，可能是由于测序技术、检测方法的敏感性或样本肿瘤组织微环境的差异。由于纳入研究在报告上的不一致，本研究无法对比 TT 和 NT 中门和属的相对丰度，也无法分析细菌群落与 OSCC 临床特征的关联。
细菌可能通过多种机制促进致癌，如产生醛类物质导致 DNA 损伤和突变、引发菌群失调等。例如，伴放线聚集杆菌（Aggregatibacter actinomycetemcomitans）产生的细胞致死膨胀毒素（CDT）可作为毒力因子，干扰细胞内信号通路，导致 KRAS 突变，激活 ATM 激酶，使细胞周期停滞，进而促进致癌过程。此外，牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）等细菌的毒力因子可刺激促炎细胞因子的产生，激活抗凋亡信号通路，促进癌细胞增殖和侵袭。同时，一些细菌在致癌过程中可能具有双重作用，如某些研究发现链球菌（Streptococcus）具有抗肿瘤特性，而牙龈卟啉单胞菌则表现出促肿瘤活性。
尽管基于口腔细菌群落的诊断和治疗为 OSCC 的研究带来了希望，但目前相关文献有限，且 TT 临床病理特征报告的不一致阻碍了全面分析。未来研究需要进一步阐明细菌在 OSCC 中的作用，尤其是与临床病理因素的关联，并探索其在治疗和预后策略开发中的潜力。
在细菌多样性方面，不同研究关于 TT 和 NT 的结果差异较大。α 多样性指数结果不一致，可能是由于 NT 的异质性、OSCC 的分期不同等因素导致。β 多样性的报告较少且不充分，这凸显了目前在细菌多样性研究方面的不足，需要更标准化的研究方法来深入探究。
本系统综述存在一些局限性，如样本量差异、患者队列不同、活检方法、临床分期报告和微生物分析技术的差异，以及潜在的发表偏倚等，这些因素可能影响研究结果的普遍性。此外，研究人群的多样性、生活方式和饮食等混杂因素未充分报告，且缺乏全面的 β 多样性分析，限制了对细菌群落变化的评估。
研究结论
本综述对比了 TT 和 NT 中细菌分类群的专属和相对丰度，为了解口腔癌独特的微生物谱提供了有价值的见解。然而，样本采集、测序技术、分类分辨率和人群差异等方面的变异性，限制了研究结果的普遍性。未来研究需采用标准化的采样方案、一致的测序方法和精确的细菌物种鉴定，以明确细菌在 OSCC 发病机制中的作用，并将研究成果转化为临床适用的诊断和治疗策略。对本系统综述中鉴定出的细菌分类群进行进一步研究，有望推动对细菌介导的 OSCC 致癌机制的理解。
