USP28-SOX9 轴调控卵巢癌 PARPi 耐药机制及靶向治疗新策略

为解决卵巢癌 PARP 抑制剂（PARPi）耐药问题，研究人员开展了关于卵巢癌对 PARPi 耐药机制及克服策略的研究。结果发现 USP28 通过稳定 SOX9 促进 DNA 损伤修复，导致耐药，而抑制 USP28 可增敏。该研究为克服 PARPi 耐药提供了新方向。

　　卵巢癌是全球范围内致死率极高的妇科恶性肿瘤，早期症状隐匿，多数患者确诊时已处于晚期，5 年生存率不足 30%。铂类化疗是常见治疗手段，但大部分晚期患者易复发且治疗选择有限。2014 年起，PARP 抑制剂（PARPi）获批用于卵巢癌维持治疗，显著延长了患者生存期。然而，部分患者对 PARPi 存在原发性耐药，还有不少患者在治疗过程中会产生获得性耐药，这极大地限制了 PARPi 的疗效，因此，深入探究卵巢癌对 PARPi 耐药的分子机制并开发新的联合治疗策略迫在眉睫。

山东大学齐鲁医院的研究人员针对这一难题展开研究，相关成果发表在《Cell Death and Disease》杂志上。该研究发现了 USP28-SOX9 轴在卵巢癌 PARPi 耐药中的关键作用，为克服耐药提供了新的潜在策略，具有重要的临床意义。

研究人员开展此项研究时，运用了多种关键技术方法。细胞实验方面，培养多种卵巢癌细胞系，包括 SKOV3、UWB1.289 及 PARPi 耐药的 SKOV3/Ola 细胞系等，并对其进行基因转染、敲低或过表达处理。采用免疫共沉淀（Co-IP）技术验证蛋白质间相互作用；利用质谱（MS）分析鉴定与 SOX9 相互作用的蛋白；通过染色质免疫沉淀测序（ChIP-Seq）确定 SOX9 结合的基因位点；还进行了动物实验，构建裸鼠移植瘤模型评估药物疗效。同时，使用了山东大学齐鲁医院收集的卵巢癌患者的高级别浆液性卵巢癌（HGSOC）组织样本进行相关检测分析。

下面介绍该研究的具体结果：

1. SOX9 促进卵巢癌对奥拉帕利耐药：研究人员综合分析 HGSOC 高表达基因、卵巢癌高表达基因和奥拉帕利耐药细胞高表达基因数据，发现 SOX9 在奥拉帕利耐药的 SKOV3 细胞中表达更高。敲低 SOX9 可显著增加 SKOV3/Ola 细胞对奥拉帕利的敏感性，而过表达 SOX9 则导致细胞耐药。体内实验也证实，SOX9 能增强卵巢癌细胞对奥拉帕利的耐药性，表明 SOX9 在卵巢癌对奥拉帕利耐药中起重要作用。
2. PARPi 促进 SOX9 与 USP28 相互作用：通过质谱分析发现 USP28 是与 SOX9 相互作用的新蛋白，GST pull-down 实验验证了二者的直接相互作用。进一步研究确定了 USP28 的 USP 结构域和 SOX9 的 K2 结构域是相互作用的关键区域。同时，发现奥拉帕利处理可增强 USP28 与 SOX9 的结合，减弱 SOX9 与 E3 泛素连接酶 FBXW7 的结合，提示 USP28 可能参与调控 SOX9 的泛素化过程。
3. USP28 调节 SOX9 蛋白稳定性：敲低 USP28 导致 SOX9 蛋白水平下降，过表达 USP28 则增加 SOX9 蛋白水平，且呈剂量依赖性。半衰实验表明，USP28 可延长 SOX9 的半衰期，维持其稳定性。此外，USP28 的催化活性对调节 SOX9 的泛素化至关重要，其可去除 SOX9 的 K48 连接的多聚泛素链，抑制 SOX9 的降解。
4. USP28 通过 SOX9 促进奥拉帕利耐药：敲低 USP28 可提高卵巢癌细胞对奥拉帕利的敏感性，过表达野生型 USP28（WT USP28）则使细胞产生耐药，而催化失活的 USP28^C171A无此作用。在 SKOV3/Ola 细胞中，敲低 USP28 同样增强了细胞对奥拉帕利的敏感性。而且，SOX9 敲低可阻碍 USP28 过表达诱导的耐药作用，表明 USP28 通过 SOX9 促进卵巢癌对奥拉帕利的耐药。
5. SOX9 直接结合并调节 DDR 基因：ChIP-Seq 分析显示，SOX9 可直接结合关键 DNA 损伤修复（DDR）基因 SMARCA4、UIMC1 和 SLX4 的启动子区域，且奥拉帕利处理后结合增强。敲低或过表达 SOX9 分别降低或增加这些基因的 mRNA 和蛋白水平。同时，USP28 可通过与 SOX9 相互作用调节这些 DDR 基因的表达，说明 USP28/SOX9 轴正向调控 DDR 基因表达。
6. USP28/SOX9 减轻奥拉帕利诱导的 DNA 损伤：免疫荧光（IF）染色和彗星实验（Comet Assay）表明，敲低 SOX9 导致奥拉帕利处理后卵巢癌细胞中 RAD51 焦点积累减少，γH2AX 焦点积累增加，DNA 损伤加重；而过表达 SOX9 则相反。同样，敲低 USP28 或使用其抑制剂 AZ1 也有类似效果，表明靶向 USP28/SOX9 可引发 DNA 双链断裂损伤，阻碍同源重组修复。
7. USP28 抑制剂使卵巢癌对奥拉帕利敏感：MTT 实验、集落形成实验和动物实验均表明，USP28 抑制剂 AZ1 与奥拉帕利联合使用，可显著增强奥拉帕利的抗肿瘤效果，增加细胞凋亡，抑制肿瘤生长，提示联合使用 USP28 抑制剂和奥拉帕利有望克服卵巢癌对 PARPi 的耐药性。

研究结论和讨论部分指出，SOX9 蛋白稳定性受多种因素调控，在肿瘤发生发展中起重要作用。本研究首次发现 USP28 是卵巢癌中与 SOX9 相互作用的新蛋白，USP28 通过去除 SOX9 的 K48 连接的多聚泛素链，抑制其降解，维持 SOX9 稳定性。同时，SOX9 通过直接结合 DDR 基因启动子，调节基因表达，促进 DNA 损伤修复，导致卵巢癌对奥拉帕利耐药。抑制 USP28 可降低 SOX9 蛋白水平，增强卵巢癌细胞对奥拉帕利的敏感性。此外，已有多种针对 USP28 的小分子抑制剂被开发，本研究中 AZ1 与奥拉帕利联合治疗展现出良好前景，为临床克服卵巢癌 PARPi 耐药提供了新的实验依据和治疗策略，有望改善卵巢癌患者的预后。