实时表征 MAPK 通路：基于天然质谱技术的深度洞察

为探究 MAPK 通路中核苷酸、药物与蛋白质的相互作用等问题，研究人员利用天然质谱（MS）技术开展对 MAPK 通路的研究。结果发现 MEK1 能调节 BRAF 复合物的核苷酸结合等。该研究为深入理解 MAPK 通路提供依据，助力相关疾病研究。

　　在细胞的信号传递 “高速公路” 上，有一条至关重要的通路 —— 丝裂原活化蛋白激酶（MAPK，Mitogen-Activated Protein Kinase）通路，它如同精密的桥梁，连接着细胞外的信号与细胞内的各种反应，对细胞的生长、分化和代谢等过程进行着精准调控。然而，这条通路一旦失控，就像脱缰的野马，会引发一系列严重的问题，其中最为突出的便是癌症。例如，在许多癌症患者体内，MAPK 通路中的关键蛋白发生了过度激活的突变，导致细胞开始不受控制地疯狂生长，最终形成肿瘤。

以往，科研人员虽然运用了多种技术来探索这条神秘的通路，但仍有许多关键细节未被完全揭示。为了更深入地了解 MAPK 通路的奥秘，来自美国德克萨斯 A&M 大学（Texas A&M University）的研究人员展开了一项具有创新性的研究。他们的研究成果发表在《Communications Biology》杂志上，为我们打开了一扇全新的认识 MAPK 通路的大门。

研究人员采用的主要技术方法是天然质谱（MS，Mass Spectrometry）技术，这是一种能够保留非共价相互作用的生物物理技术，可用于研究蛋白质 - 蛋白质相互作用、监测蛋白质的磷酸化过程等。利用该技术，研究人员对 MAPK 通路进行了全方位的探究。

研究结果如下：

1. BRAF - MEK 复合物的生物物理特性：从昆虫细胞中纯化得到的（MEK1）（BRAF）复合物，其天然质谱显示存在不同的化学计量比，且含有共纯化的 14 - 3 - 3 二聚体。研究还发现，添加重组 MEK1 可使（MEK1）（BRAF）（14 - 3 - 3）₂的丰度增加。此外，当加入三磷酸腺苷（ATP）时，MEK1 与 BRAF 结合会增强 ATP 与复合物的结合能力；而加入 MEK 抑制剂 GDC - 0623 后，它仅与（MEK1）（BRAF）（14 - 3 - 3）₂复合物结合。
2. KRAS 与 RAF 不同片段的结合情况：研究表明，KRAS 突变体与 CRAF 的 RBD（CRAF - RBD）和含有半胱氨酸富集结构域（CRD）的 CRAF - RBDCRD 的结合亲和力比野生型 KRAS 更高，且 CRD 的加入进一步增强了这种结合。同时，KRAS 及其致癌突变体与（BRAF）（14 - 3 - 3）₂的结合亲和力比与（MEK1）（BRAF）（14 - 3 - 3）₂更强。
3. RAF 结合对 KRAS GTP 酶活性的影响：在 BRAF 复合物存在时，KRAS 的 GTP 酶活性无显著变化；但 CRAF - RBD 和 CRAF - RBDCRD 能使 KRAS 的 GTP 酶活性提高约三倍。对于 KRAS 突变体，（MEK1）（BRAF）（14 - 3 - 3）₂复合物的存在与否对其 GTP 酶活性影响不大，不过加入 CRAF - RBD 和 CRAF - RBDCRD 后，其 GTP 酶活性会加快。
4. 实时监测 MAPK 磷酸化级联反应：研究人员利用天然质谱技术实时监测 ERK2 的磷酸化过程。在 KRAS?GTP 存在的情况下，ERK2 在反应开始时主要为未磷酸化状态，40 分钟后出现单磷酸化和双磷酸化形式，80 分钟时完全双磷酸化。加入 GDC - 0623 后，ERK2 的磷酸化被完全阻断。通过对反应动力学的分析，研究人员还计算出了 ERK2 磷酸化的动力学参数。

研究结论和讨论部分指出，天然质谱分析为 MAPK 通路中蛋白质 - 蛋白质和蛋白质 - 配体的相互作用提供了详细的见解，有助于优化样本以进行结构研究。同时，研究发现致癌 KRAS 突变体与野生型相比，与截断形式的 CRAF 和 BRAF 复合物具有更高的结合亲和力，且在与不同 RAF 片段结合时，其核苷酸水解情况也有所不同。此外，天然质谱技术能够实时监测 ERK 的磷酸化，为研究 MAPK 信号通路提供了一种直接且详细的方法，这是其他传统方法如蛋白质免疫印迹（Western blotting）所无法比拟的。这项研究为深入理解 MAPK 信号通路的机制提供了重要依据，有望为癌症等相关疾病的治疗和药物研发开辟新的方向，具有重要的理论和实践意义。