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在体育反兴奋剂检测中，生长激素类似物索马托戈（Somatrogon）的检测面临挑战。研究人员开展了用 LC-HRMS/MS 技术检测兴奋剂控制尿液样本中索马托戈的研究。结果显示该方法灵敏且特异，能在多数受试者尿液中检测到索马托戈至少 96 小时，为反兴奋剂检测提供新途径。
在体育竞技的舞台上，公平竞争是基石，然而兴奋剂的使用却如同隐藏在暗处的毒瘤，侵蚀着体育精神。生长激素（Growth Hormone，GH）作为一种常见的兴奋剂，其类似物索马托戈（Somatrogon）在体育赛事中的滥用现象逐渐引起关注。索马托戈是一种新型重组长效 GH 类似物，由于其具有与 hGH 相似的脂解和合成代谢作用，被世界反兴奋剂机构（World Anti-Doping Agency，WADA）列入禁用清单。但传统的免疫检测方法在检测索马托戈时存在局限性，部分免疫检测试剂盒无法有效识别该药物，这使得运动员使用索马托戈进行违规操作有了可乘之机，严重破坏了体育赛事的公平性。为了填补这一检测空白，保障体育赛事的公正，德国体育大学科隆分校（Institute of Biochemistry/Center for Preventive Doping Research, German Sport University Cologne）等机构的研究人员开展了深入研究。
研究人员通过一系列实验，成功开发并优化了一种基于亲和纯化、胰蛋白酶消化和液相色谱 - 高分辨率质谱 / 质谱（Liquid Chromatography-High Resolution Mass Spectrometry/Mass Spectrometry，LC-HRMS/MS）的检测方法，用于检测尿液样本中的索马托戈。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为反兴奋剂检测领域带来了新的突破。
在研究方法上，研究人员首先对样本进行处理。他们从志愿者和索马托戈给药研究对象中收集尿液样本，在样本中加入内标（U-1?N 标记的 22kDa GH）后，通过超滤进行初步浓缩，再利用与重组人 GH 受体（GHR）Fc 融合蛋白结合的磁性微球进行亲和纯化，将目标蛋白分离出来。接着，使用胰蛋白酶对纯化后的样本进行消化，使其分解为便于检测的肽段。最后，采用 LC-HRMS/MS 技术对消化后的样本进行分析，通过精确测量肽段的质荷比等参数，实现对索马托戈的定性和定量检测。同时，研究人员还依据 WADA 指南对该方法进行了全面的验证，确保其可靠性和有效性。
在研究结果方面：
- 质谱检测索马托戈：研究人员对比了固相萃取（Solid-Phase Extraction，SPE）和超滤两种样本浓缩方法，发现超滤不仅操作更简便，而且灵敏度更高。利用优化后的方法，在索马托戈给药后的尿液样本中，成功检测到了对应不同糖基化和羟基化异构体的目标肽段，且在注射后 96 小时内均可检测到。这表明完整或接近完整的索马托戈融合蛋白存在于尿液中，与以往认为该药物会被蛋白酶降解而不会随尿液排出的观点相悖。
- 方法学验证：该检测方法表现出高特异性、可靠性（在 10ng/mL 浓度下）和 1 - 100ng/mL 范围内的良好线性关系。检测限为 1ng/mL，通过增加样本量或进样量可进一步提高灵敏度。缩短胰蛋白酶消化时间虽能检测到所有目标肽段，但部分肽段强度降低。同时，实验证明磁性微球经充分洗涤后可重复使用，LC-HRMS/MS 检测过程中的携带污染低于 1%，尿液样本提取物在自动进样器中至少可稳定保存 3 天。超滤和亲和纯化结合的回收率约为 27%，表明样本提取过程中存在一定的分析物损失。
- 索马托戈稳定性：研究索马托戈在尿液中的稳定性发现，在 4°C 和室温下，该药物至少在 2 周内保持稳定。这意味着在实际反兴奋剂检测中，尿液样本在常温运输和冷藏保存数天的情况下，不会影响索马托戈的检测结果。
- 给药研究样本分析：对索马托戈给药研究的尿液样本分析显示，不同个体间索马托戈的尿排泄差异较大。部分受试者在注射后 2 - 96 小时的尿液样本中可检测到索马托戈的目标肽段，而部分受试者则检测不到或仅检测到少量肽段。这可能与个体间药物生物利用度、蛋白质代谢和肾脏排泄的差异有关。此外，样本基质中的某些因素，如蛋白酶或其他蛋白质的含量，会干扰药物的提取和检测。
- 尿液索马托戈的表征：通过蛋白质免疫印迹（Western blotting）实验进一步表征尿液中的索马托戈，结果显示在注射索马托戈 8 小时后的尿液样本提取物中，检测到与索马托戈参考物质分子量相近的条带，再次证实完整或接近完整的索马托戈随尿液排出。同时，也发现了一些其他条带，但经实验证明是由非特异性结合产生的假象。
- hGH 同工型差异免疫分析检测尿液样本：研究人员评估了 hGH 同工型差异免疫分析在尿液索马托戈检测中的适用性。结果表明，使用试剂盒 2 检测时，索马托戈给药后的尿液样本中可检测到药物，且浓度在注射后 12 - 48 小时达到峰值，为 13 - 150ng/mL。但试剂盒 1 和试剂盒 2 检测结果存在差异，这可能是由于试剂盒中抗体与索马托戈代谢物的结合特性不同。此外，分析 95 份常规兴奋剂检测尿液样本后发现，约 70% 样本中 rhGH 浓度低于试剂盒检测限，约 18% 样本中 rhGH 浓度高于 100pg/mL，6% 样本中高于 1ng/mL。通过对比试剂盒 1 和试剂盒 2 检测索马托戈给药样本和参考样本中 rhGH 浓度的差异，发现 Rec2/Rec1 比值可作为筛选潜在含索马托戈尿液样本的指标，以便进一步用 LC-HRMS/MS 分析。
综上所述，该研究成功开发了一种可用于检测尿液中索马托戈的高灵敏度和特异性的 LC-HRMS/MS 方法。研究结果表明，尿液可作为检测索马托戈的有效生物样本，这为反兴奋剂实验室提供了新的检测途径，有助于更准确地识别运动员是否使用索马托戈进行违规操作，维护体育赛事的公平公正。同时，研究还评估了现有免疫分析方法在尿液索马托戈检测中的适用性，为反兴奋剂检测方法的选择和优化提供了重要参考。未来，研究人员可进一步探索索马托戈在体内的代谢机制，以及如何更精准地检测其代谢产物，不断完善反兴奋剂检测体系，为纯净的体育赛事保驾护航。
