基于流动注射串联质谱（FIA-MS/MS）分析分枝菌酸实现分枝杆菌属物种的精准检测与鉴定 —— 开启结核病诊疗新篇章

为解决分枝杆菌物种鉴定困难的问题，研究人员开展了运用流动注射串联质谱（FIA-MS/MS）分析分枝菌酸来鉴定分枝杆菌物种的研究。结果显示该方法可靠、灵敏度高，在临床诊断、流行病学监测等方面意义重大。

　　在神秘的微生物世界里，分枝杆菌属可是个 “不好惹” 的角色。它包含众多成员，像引发结核病（Tuberculosis，TB）的结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis） ，还有导致麻风病的麻风分枝杆菌（Mycobacterium leprae） ，以及越来越受关注的非结核分枝杆菌（non-tuberculous mycobacteria，NTM） 。这些分枝杆菌的 “长相” 和 “性格” 十分多样，给物种鉴定和分类带来了极大挑战。传统的鉴定方法，比如基于培养的方法，不仅耗时费力，而且很多分枝杆菌生长缓慢，等结果出来往往需要好几周，一些菌种的生化特征还相互重叠，很难区分。分子技术，像聚合酶链反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）和 16S rRNA 基因测序，虽然准确性有所提高，但也存在依赖专业设备、受物种内基因变异性影响等问题。

为了攻克这些难题，来自波兰多个研究机构的研究人员开启了一场探索之旅。他们聚焦于分枝杆菌细胞壁上一种独特的物质 —— 分枝菌酸（Mycolic acids）。这是一类长链 α - 烷基，β - 羟基脂肪酸，是分枝杆菌属的 “专属标志”，在维持细胞壁结构完整性和致病性方面起着关键作用。不同分枝杆菌物种的分枝菌酸在链长、不饱和度和官能团修饰等方面存在差异，是理想的分类标记。研究人员运用流动注射分析结合串联质谱（Flow Injection Analysis - Tandem Mass Spectrometry，FIA-MS/MS）技术，对分枝菌酸进行全面分析，旨在开发一种快速、准确且可扩展的分枝杆菌物种鉴定方法。该研究成果发表在《Scientific Reports》上，为分枝杆菌相关疾病的诊疗和研究带来了新的曙光。

在这项研究中，研究人员主要运用了以下关键技术方法：

1. 样本制备：采用 M-Typer 试剂试剂盒，对分枝杆菌细胞悬液或痰液样本依次进行高温碱性水解、中和、液 - 液萃取等步骤，获取分枝菌酸提取物。
2. FIA-MS/MS 分析：使用 QTRAP 6500 + 串联质谱仪和 ExionLC AD 液相色谱仪，在负电喷雾电离（ESI）模式下，通过多反应监测（MRM）模式检测 52 种分枝菌酸的特定离子跃迁，同时运用非靶向质谱方法探索潜在耐药性。
3. 数据处理：利用 M-Typer 软件对提取离子色谱图（XIC）进行积分，将生成的分枝菌酸谱与软件库中 331 株分枝杆菌的参考数据对比，计算相似度得分；运用主成分分析（PCA）评估分枝菌酸谱区分不同菌株和群体的能力。

下面来看看具体的研究结果：

1. 样本制备优化：对传统的分枝菌酸分离方案进行 18 处改进，包括细胞预处理、调整碱水解参数、优化萃取过程等。优化后的方法在灵敏度、稳健性和整体分析性能上都有显著提升。
2. 分析方法验证：全面评估了包括回收率、灵敏度、检测限（Limit of Detection，LOD）、定量下限（Lower Limit of Quantitation，LLOQ）、工作范围、精密度、重复性、再现性、相对诊断灵敏度和诊断特异性等参数。结果表明该方法可靠性高，适用于临床诊断和研究。
3. 回收率和方法性能：在健康志愿者的尿液和痰液样本中添加结核分枝杆菌的分枝菌酸混合物进行回收实验，不同浓度下回收率良好，在较低添加浓度（1 μg/mL）时灵敏度高，基质干扰小。
4. 检测限、定量限和工作范围：对结核分枝杆菌 H37Rv ATCC 25618、耻垢分枝杆菌（Mycobacterium smegmatis）ATCC 19420 和脓肿分枝杆菌（Mycobacterium abscessus）ATCC 23045 三种参考菌株进行测试，该方法检测灵敏度高，能检测到单个分枝杆菌细胞，工作范围跨越 6 个数量级。
5. 方法精密度、重复性和再现性：对上述三种菌株进行实验，结果显示该方法具有出色的精密度、重复性和再现性。
6. 分枝菌酸作为化学分类生物标志物：通过 PCA 分析参考菌株和临床分离株的分枝菌酸谱，发现不同物种能明显区分开。不同分枝杆菌物种的分枝菌酸谱存在差异，如结核分枝杆菌复合物（Mycobacterium tuberculosis complex，MTB）以较长 α - 烷基链（C₂₄）的分枝菌酸为主 ，而特定的 a₂ -MAs 仅存在于 MAI 组和某些 NTM 菌株中。
7. 基于分枝菌酸谱的耐药性测定：对不同耐药性的 MTB 和 NTM 菌株的分枝菌酸谱分析发现，MTB 菌株虽不能精确确定耐药谱，但可判断是否耐药；NTM 菌株则无法区分敏感和耐药菌株。
8. 干扰测试和分析方法的选择性：对其他含分枝菌酸的细菌进行检测，未出现假阳性信号，表明该方法特异性强。
9. 临床验证 FIA-MS/MS 分枝菌酸谱检测分枝杆菌感染：分析临床样本发现，FIA-MS/MS 能检测出分枝杆菌感染患者样本中的特异性分枝菌酸谱，且与参考库匹配度高。该检测方法特异性为 100%，灵敏度为 91.6%，阴性预测值（Negative Predictive Value，NPV）为 98.2%，阳性预测值（Positive Predictive Value，PPV）为 100% 。

研究结论和讨论部分指出，分枝菌酸作为分枝杆菌细胞壁的独特成分，是极佳的生物标志物。FIA-MS/MS 方法相比传统技术，在诊断灵敏度和特异性上更具优势，能快速准确鉴定分枝杆菌物种，对结核病管理和个性化医疗意义重大。虽然该方法在检测 MTB 耐药性方面有一定作用，但对于 NTM 耐药性的区分还存在局限。未来研究可进一步优化样本制备，扩大样本队列，提高成本效益，以拓展该方法在环境和临床微生物学领域的应用。这项研究为分枝杆菌相关疾病的诊断、治疗和研究开辟了新路径，有望改善患者的诊疗效果，推动微生物致病机制研究的发展。