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为解决现有光控蛋白表达技术的不足，如基于光诱导启动子的方法存在时间延迟、RNA 化学修饰影响生物活性等问题，研究人员开展了光笼化胍基连接吗啉代二氨基磷酸酯寡核苷酸（GMO-PMO）调控 mRNA 翻译的研究。结果显示该方法能时空控制蛋白表达，影响胚胎发育，为生物医学研究和治疗提供新策略。
在生命科学研究的舞台上，精准调控蛋白质的表达就像掌控一场精密的交响乐，每个音符（蛋白质）都需要在正确的时间和地点奏响，才能演绎出生命的精彩篇章。然而，目前的 “指挥棒”—— 光控蛋白表达技术，却存在着诸多不和谐的 “音符”。传统的基于光诱导启动子的方法，就像一个反应迟缓的指挥，在启动子诱导和蛋白质翻译之间存在着明显的时间延迟，这对于研究快速的生物过程来说，无疑是一场灾难。而对 RNA 进行化学修饰的方法，虽然看似能解决一些问题，但却像是给 “乐器”（mRNA）动了一场不太成功的手术，常常会损害 mRNA 的生物活性，让其无法正常 “演奏”。此外，使用光敏感的吗啉代寡核苷酸（photo morpholinos）的方法，又因为需要针对每个特定基因进行单独设计，合成难度大，且 uncaging 效率和生物活性难以保证，使得这一技术难以广泛应用。
为了让这场 “交响乐” 重回正轨，德国明斯特大学分子炎症中心（ZMBE）细胞生物学研究所、印度科学培养协会应用与跨学科科学学院以及德国明斯特马克斯?普朗克分子生物医学研究所的研究人员携手合作，开启了一项意义非凡的研究之旅。他们的目标是开发一种高效、强大且广泛适用的光诱导蛋白质翻译系统，以此来精确控制目标蛋白质的产生，并深入研究其功能。经过不懈努力，他们成功开发出了这样一个系统，该系统基于光笼化的 GMO-PMO，通过紫外线照射，能将与 RNA 结合的反义吗啉代（antisense morpholino）置换出来，从而启动 mRNA 的翻译。这一系统就像一个精准的 “调音师”，可以在活胚胎的特定时间和位置，精确地调控蛋白质的表达，影响胚胎的发育进程。这项研究成果发表在《Nature Communications》上，为生命科学研究带来了新的曙光。
在研究过程中，研究人员运用了多种关键技术方法。他们通过优化合成条件，采用无汞方法在固相载体上合成了 GMO-PMO 嵌合体。在斑马鱼实验中，利用显微注射技术将 mRNA 和寡核苷酸注入斑马鱼胚胎的卵黄中，再通过激光照射激活光笼化的 GMO-PMO，从而实现对蛋白质表达的时空控制。同时，运用共聚焦显微镜成像技术观察胚胎发育过程中蛋白质的表达和细胞的变化情况。
下面让我们来深入了解一下这项研究的主要成果：
- 诱导荧光蛋白表达：研究人员将核靶向绿色荧光蛋白（GFP）的开放阅读框克隆到 pTIS 质粒中，然后将产生的 mRNA 与翻译阻断吗啉代（tbMO）和 “无活性” 的 cPMO2 一起注入斑马鱼胚胎。在未照射时，tbMO 抑制了核 GFP 转录本的翻译，无法观察到 GFP 信号。而局部照射后，cPMO2 被激活，它能 “抓住” tbMO，使得 GFP 得以翻译并在细胞核内积累。实验结果显示，使用 cPMO2 时，89% 的照射胚胎表现出局部 GFP 表达，而使用常规 cPMO1 时，只有 45% 的胚胎有此表现，这表明 cPMO2 在置换 tbMO 方面更有效，且细胞通透性更好。
- 局部诱导毒素表达：为了研究系统是否能在发育组织的特定时间和位置诱导细胞死亡，研究人员将编码毒素（Kid）的基因克隆到 pTIS 质粒中。实验发现，当 tbMO 抑制 Kid 编码 RNA 的翻译时，胚胎在紫外线照射下能正常发育，说明照射本身不影响细胞存活。而加入 cPMO2 并照射后，翻译抑制被解除，毒素表达导致照射区域的细胞死亡，通过检测激活的 caspase-3 蛋白（细胞凋亡的标志物）可以监测到凋亡细胞的数量。
- 局部诱导形态发生蛋白表达：组织、器官和动物的正常发育离不开细胞间的相互作用和信号传递，形态发生蛋白在其中起着关键作用。研究人员通过光诱导骨形态发生蛋白（Bmp2b）或 β - 连环蛋白（β-catenin，Ctnnb1）的表达来探究系统在体内指导细胞分化的潜力。结果显示，光诱导 Bmp2b 表达会损害背侧组织的发育，导致头部结构明显缺失；而诱导 β -catenin 表达则会使胚胎细胞向背侧中胚层分化，表现为背侧中胚层标记基因（no tail31）的表达增加。这表明光照射释放的笼蔽基团不会影响细胞转录内源性基因 RNA 的能力，且该处理具有特异性。
- 在发育后期局部诱导蛋白质表达：研究人员以斑马鱼胚胎后外侧线原基（pLLP）的迁移为例，评估该方法在胚胎发育后期（受精后 24 小时以后）的应用效果。pLLP 的迁移受 Cxcr4-Cxcl12a 信号通路调控，而该信号通路又依赖于受体 Cxcr7 的表达。研究人员假设在 pLLP 前端诱导 Cxcr7 表达会破坏 Cxcl12a 梯度，减少 pLLP 的迁移距离。实验结果证实了这一假设，与未照射的对照组或表达对照蛋白（mCherry）的照射胚胎相比，诱导 Cxcr7 表达的照射胚胎中 pLLP 的迁移明显减少。
在讨论部分，研究人员指出他们开发的光遗传学系统克服了现有技术的诸多障碍。该系统使用通用的报告构建体和标准化的半自动化合成方法，使得寡核苷酸的活性易于标准化，适用于广泛的应用。与之前的系统不同，该系统使用两个寡核苷酸，在激活目标 RNA 水平和控制残留背景翻译方面具有更大的灵活性，这对于表达高比活性的蛋白质（如毒素）至关重要。此外，该方法不仅适用于斑马鱼胚胎，还可用于细胞和类器官的研究，通过同源重组和转染技术，有望调节内源性基因的翻译。
总的来说，这项研究成功开发了一种简单且广泛适用的光诱导和光抑制蛋白质表达系统，为生命科学研究提供了一种强大的工具。它能够在活胚胎中精确控制蛋白质水平，实现特定的生物学效应，对基础研究和医学相关实验具有深远的影响，就像为生命科学的研究打开了一扇新的大门，让我们能够更加深入地探索生命的奥秘。
