金属离子介导的功能二分法：解码翻译质量控制中的可塑性奥秘

在翻译质量控制研究中，为探究 AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 对氧化应激敏感性差异的机制，研究人员开展了相关研究。结果发现，Zn2+对 AlaRS-Ed 结构和校对活性并非必需，但能保护其免受 ROS 影响；ThrRS-Ed 则易受 ROS 干扰。这揭示了翻译质量控制与氧化还原信号的关联。

　　在生命的微观世界里，基因翻译就像一场精准的 “蛋白质制造工厂流水线作业”，每个环节都至关重要。翻译质量控制如同这条流水线的 “质量监督员”，不仅要保证蛋白质合成的准确性，还要在压力条件下灵活调整，为细胞的生存和发展提供保障。然而，长期以来，科学家们对于一类重要的校对模块，即以丙氨酰 - tRNA 合成酶（alanyl-tRNA synthetase，AlaRS）和苏氨酰 - tRNA 合成酶（threonyl-tRNA synthetase，ThrRS）的编辑结构域为代表的模块，其中金属离子结合位点在长达约 35 亿年的进化过程中始终保持保守的作用机制，知之甚少。这就好比在工厂里，虽然知道某个关键设备一直存在且很重要，但却不清楚它到底是如何运作的，这一谜题困扰着众多科研人员。为了解开这个谜团，中国科学院细胞与分子生物学中心（CSIR-Centre for Cellular and Molecular Biology）的研究人员展开了深入研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们揭示了这一神秘机制背后的真相。
研究人员主要运用了以下几种关键技术方法：一是序列和结构分析技术，通过从数据库获取 AlaRS、AlaXps 和 ThrRS 的序列，进行结构比对和系统发育树构建，来探究它们之间的进化关系；二是蛋白质相关技术，包括蛋白质的克隆、表达、纯化，以及利用各种生化测定方法，如去除 Zn²⁺、进行 PAR 检测、热迁移分析、结晶和结构测定等，来研究蛋白质的性质和功能；三是构建相关模型，如构建大肠杆菌缺失突变体，进行斑点稀释实验和 GFP 误译检测实验，从细胞水平探究相关机制。
研究结果如下：

1. AlaRS-Ed 中普遍保守的 Zn²⁺对结构和校对活性并非必需：研究人员通过螯合剂去除纯化的 EcAlaRS WT 和 PhoAlaX-M 中的 Zn²⁺，并进行去酰化实验，发现无论是全酶还是脱辅基酶形式，都能以相同效率去酰化 Ser - (Ec) tRNA^Ala和 Gly - (Ec) tRNA^Ala，且对同源 Ala - (EC) tRNA 无活性，这表明 Zn²⁺对 AlaRS-Ed 的校对活性不是必需的。同时，通过结构分析和蛋白质热迁移实验发现，去除 Zn²⁺对 AlaRS-Ed 的结构稳定性没有显著影响。
2. 不同的 Zn²⁺结合方式导致 ROS 对 AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 活性的相反影响：研究人员发现 AlaRS-Ed 与 Zn²⁺的结合亲和力比 ThrRS-Ed 更强，且游离的 Zn²⁺对两者的校对活性有相反影响。体外去酰化实验表明，H₂O₂处理后，AlaRS-Ed 全酶的校对活性不受影响，而脱辅基酶则出现明显缺陷，这说明普遍保守的 Zn²⁺在 AlaRS-Ed 中起到保护其活性免受 ROS 影响的作用。通过 Ellman 试剂检测发现，AlaRS-Ed 中与 Zn²⁺结合的半胱氨酸残基的巯基能被保护不被氧化，而 ThrRS-Ed 中的相应半胱氨酸则容易被氧化。
3. 设计 AlaRS-Ed 变体用于体内探究 Zn²⁺的作用：研究人员设计了一种 AlaRS-Ed 变体（如 EcAlaRS H568A 和 PhoAlaX-M H103A），该变体除了不能结合 Zn²⁺外，保留了所有天然功能特性。体外实验表明，这些变体对 H₂O₂更敏感，其行为类似于 ThrRS-Ed，适合用于体内研究。
4. Zn²⁺在体内保护 AlaRS-Ed 活性并防止 Ala 密码子误译：通过构建大肠杆菌双敲除菌株 MG1655ΔalaS Δdtd，并分别用 EcalaS^WT或 EcalaS^H568A进行互补，研究人员进行了斑点稀释细胞活力测定和基于 GFP 的细胞报告实验。结果表明，Zn²⁺结合的 AlaRS-Ed 能保护其活性免受 ROS 影响，防止细胞中 Ala 密码子的错误翻译，维持细胞正常生长。
5. AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 不同 Zn²⁺结合的结构基础：结构分析显示，尽管 AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 具有相似的折叠和相同的 Zn²⁺结合基序，但它们在 Zn²⁺结合上存在差异。AlaRS-Ed 的配体残基能形成四面体配位球来结合 Zn²⁺，而 ThrRS-Ed 的配位球则因关键疏水壳残基 Y173 的存在而发生扭曲，导致其对 Zn²⁺的结合能力较弱。
6. 单个残基的转换使 AlaRS-Ed 对 ROS 敏感：研究人员通过生成突变蛋白（如 L655Y、T172Y 和 Y173V）进行功能测试。体外去酰化实验和体内斑点稀释活力测定表明，在 AlaRS-Ed 中引入 ThrRS-Ed 的决定因素会影响其 Zn²⁺结合能力和对 ROS 的抗性，使 AlaRS-Ed 对 ROS 敏感。
7. AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 功能二分法的前 LUCA 起源：通过系统发育分析，研究人员推断 AlaRS-Ed 和 ThrRS-Ed 的分化发生在最后共同祖先（Last Universal Common Ancestor，LUCA）之前。在 LUCA 时期，这两种酶可能就已经对 ROS 产生了不同的敏感性，这种差异影响了它们对 aa - tRNA 的质量控制，进而编码了 Ala 与 Thr 密码子的误译景观。
   研究结论和讨论部分表明，该研究揭示了 Zn²⁺离子与 AlaRS-Ed 结合的未知功能，即保护其活性免受 ROS 影响，防止细胞中 Ala 密码子的毒性误译。这种保护机制在氧化应激条件下对细胞生存至关重要，解释了为什么 Zn²⁺结合在该结构域中普遍保守。同时，研究还发现，ThrRS-Ed 对 Thr - Ser 误译的耐受性较高，使其进化出了对 ROS 敏感的校对功能。这种由 Zn²⁺介导的功能二分法编码了 Ala 与 Thr 密码子的误译景观，是一种古老的调节网络，将氧化还原信号与翻译质量控制联系起来。这一研究不仅为我们理解翻译质量控制的分子机制提供了新的视角，还揭示了生命在进化过程中如何巧妙地利用金属离子和氧化还原信号来调节蛋白质合成的准确性，对深入研究生命起源和进化以及相关疾病的发生发展机制具有重要意义。