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在药物研发和癌症治疗中，P - 糖蛋白（Pgp）介导的多药耐药（MDR）及药代动力学问题备受关注。为探究 Pgp 在药物转运中的机制，研究人员运用冷冻电镜（cryo-EM）剖析其构象变化。结果揭示多种构象，明确了转运机制和多特异性因素，为解决 MDR 及优化药物设计提供依据。
在现代医学领域，癌症治疗一直是备受瞩目的难题，其中多药耐药（MDR）现象严重阻碍了化疗的效果，使得许多抗癌药物无法发挥应有的作用。P - 糖蛋白（Pgp）作为一种重要的 ATP 结合盒（ABC）转运体，广泛存在于人体的血脑屏障、上皮细胞等部位，它能够将进入细胞的外源性物质和有毒化合物排出细胞外。这一特性虽然在维持机体正常生理功能方面发挥着重要作用，但在癌症治疗中却成为了一大阻碍，癌细胞中的 Pgp 会将化疗药物泵出细胞，导致癌细胞对多种药物产生耐药性，极大地降低了化疗的疗效。
同时，Pgp 对药物的药代动力学也有着显著影响，因其在上皮屏障部位的分布，会影响药物的吸收、分布和排泄过程。尽管科研人员对 Pgp 进行了长达数十年的研究，但 Pgp 在主动药物转运过程中的构象转变循环仍未明确，现有的 Pgp 结构与不间断的多药转运之间的精确关联也尚不清楚。这些知识空白严重制约了对 MDR 的有效预防以及新型药物的合理设计，因此，深入探究 Pgp 的作用机制迫在眉睫。
为了攻克这些难题，来自哈佛医学院细胞生物学系以及爱荷华州立大学生物化学、生物物理学和分子生物学系的 Alan T. Culbertson，与南方科技大学生命科学学院化学生物学系、南方科技大学生物电子显微镜研究所的 Maofu Liao 合作开展研究。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们理解 Pgp 的功能和作用机制带来了新的曙光。
在这项研究中，研究人员运用了多种关键技术方法。其中，冷冻电镜（cryo-EM）技术是核心手段，它能够在接近生理条件下对生物大分子的结构进行高分辨率解析。研究人员通过对纳米圆盘嵌入的人 Pgp 在不同药物转运条件下进行 cryo-EM 分析，获取了 Pgp 在药物转运过程中的多种构象信息。此外，还结合了 ATP 酶活性测定、细胞内转运实验以及分子动力学模拟等技术。ATP 酶活性测定用于检测 Pgp 在不同底物存在下的 ATP 水解活性，细胞内转运实验则直观地观察 Pgp 对底物的转运能力，分子动力学模拟从原子层面揭示了底物与 Pgp 的相互作用及动态变化。
Pgp 在纳米圆盘中的制备与生化特性分析
研究人员首先通过筛选具有高药物外排活性的细胞，成功表达并纯化了人 Pgp，随后将其重组到脂质纳米圆盘中。经检测，纳米圆盘中 Pgp 的 ATP 酶活性与先前研究相当，且在不同底物（如长春碱、维拉帕米和罗丹明）的刺激下呈现出不同的变化趋势。这表明所制备的 Pgp 在纳米圆盘中具有良好的活性，为后续研究奠定了基础。
Pgp 转运长春碱的构象变化
利用单颗粒冷冻电镜技术，研究人员对持续转运长春碱的 Pgp 进行了构象分析。通过 “多模型多分辨率（M3R）” 策略进行三维分类，获得了 Pgp 的向内开放和闭合等多种构象的冷冻电镜图。在向内开放构象中，长春碱结合在 Pgp 的中央腔，此时 TM10 发生向内弯曲，而 TM4 保持伸直状态。这些结果表明，Pgp 在转运长春碱时经历了动态的构象转变循环，涉及多种不同的构象状态。
Pgp 转运维拉帕米的构象变化
为探究 Pgp 对不同化合物的转运机制，研究人员对转运维拉帕米的 Pgp 进行了平行的冷冻电镜分析。结果显示，与转运长春碱的 Pgp 构象不同，转运维拉帕米的 Pgp 在向内开放状态下 TM10 无弯曲现象。此外，还鉴定出了一种新的中间封闭构象（Ver-ATP-OC），该构象中 TM4 和 TM10 向内弯曲，NBD 二聚化，中央腔被封闭，腔内存在与维拉帕米分子大小和形状相符的密度，表明这一构象在底物转运过程中起着关键的中间作用。
维拉帕米与 Pgp 的结合特性
在 Pgp 的向内开放构象中，维拉帕米结合在中央腔，其结合位点与长春碱有部分重叠，但也存在差异。分子动力学模拟表明，维拉帕米与 Pgp 的结合相对较弱，构象约束较少，这可能是其作为 Pgp 底物时能更高效刺激 ATP 酶活性且对 Pgp 抑制作用较小的原因。
Pgp 的外周底物结合位点
研究人员在转运长春碱或维拉帕米的 Pgp 向内开放构象中，发现了一个位于 TM4 - 5 下方的外周底物结合位点。该位点由小的疏水残基和周围较大的疏水残基形成一个浅疏水口袋，能够结合底物。通过定点突变和分子动力学模拟实验证实，底物与该外周位点的结合会影响 Pgp 的转运活性，一些底物可同时占据外周位点和中央腔，阻碍底物的输出。
与先前 Pgp 结构的比较
与先前利用抑制性 Fab 结合、交联或催化缺陷突变等技术获得的 Pgp 结构相比，本研究中不受约束的 Pgp 样本结构有所不同。例如，先前 Fab 结合的结构中 TM4 和 TM10 始终呈弯曲状态，而本研究中 apo Pgp 的 TM4 和 TM10 在某些构象中是伸直的。此外，本研究发现的外周底物结合位点在先前的结构中并未出现，这进一步凸显了本研究的创新性和重要性。
Pgp 的转运机制
综合上述研究结果，研究人员提出了 Pgp 的转运机制模型。在底物结合前，Pgp 处于向内开放状态（状态 1）。底物首先从膜的内小叶侧向移动，结合到 Pgp 的外周位点（状态 2），随后迁移至中央腔（状态 3），诱导 TM4 和 TM10 向内弯曲。部分底物可同时占据两个位点，导致底物抑制现象（状态 3i）。而有效的 TM4 和 TM10 弯曲促进 NBD 二聚化，使 Pgp 转变为封闭构象（状态 4）。底物在假设的向外开放状态（状态 5）中释放，这一状态短暂存在，难以捕捉。随后 Pgp 进入塌陷闭合状态（状态 6），NBD 水解 ATP 后解离二聚体，为下一轮转运循环重置 Pgp。
Pgp 多特异性的机制
研究揭示了 Pgp 多特异性的几个关键因素。不同程度开放的向内开放构象能够容纳各种大小和形状的分子；中央腔与不同底物的结合涉及一些共同残基，但相互作用不具有底物特异性；外周底物结合位点是一个非特异性的浅疏水口袋，能以相对较低的亲和力结合多种化合物；无论是外周位点还是中央腔，底物与 Pgp 的结合都不十分稳定，弱的、非特异性的结合更有利于高效转运。
综上所述，该研究通过冷冻电镜等技术对 Pgp 在药物转运过程中的构象变化进行了深入剖析，揭示了 Pgp 的转运机制和多特异性的分子基础。这一研究成果为理解 Pgp 介导的多药耐药机制提供了关键信息，为开发新型抗癌药物、克服多药耐药问题以及优化药物设计提供了重要的理论依据，对生命科学和健康医学领域具有重要的推动作用。
