基于微孔阵列的微型胸腺类器官模型：开启胸腺研究的高通量新时代

《Cell Reports》：Establishment of a microwell-array-based miniaturized thymic organoid model suitable for high-throughput applications

本文构建了微型胸腺类器官（mTOs）模型，其能支持 T 细胞发育，具备天然胸腺关键特征，且适用于中高通量分析和活细胞成像。该模型为研究胸腺生物学及 T 细胞发育提供新平台，有助于探索相关疾病机制与治疗策略。

　　### 微型胸腺类器官模型的研究背景
胸腺对于 T 细胞的发育至关重要，其微环境中的胸腺上皮细胞（TEC）起着关键作用。TEC 可分为皮质（c）和髓质（m）TEC 亚系，它们各自包含多种上皮亚型，在 T 细胞的发育、分化和选择过程中发挥着不同的功能 。例如，cTECs 调节 T 细胞谱系的定向、分化和阳性选择，而 mTECs 则调节中枢耐受性的诱导。

当前对胸腺生物学和 T 细胞发育的研究兴趣浓厚，主要源于三个方面：一是年龄相关的胸腺退化，会导致新的幼稚 T 细胞输出减少，增加癌症和感染的风险，影响免疫功能恢复；二是胸腺功能衰竭或早期手术切除胸腺引起的免疫缺陷；三是 T 细胞在癌症免疫疗法中的成功应用。然而，现有的体外胸腺模型存在诸多局限性，如胎儿胸腺器官培养（FTOC）和重新聚集的 FTOC（RFTOC）虽能模拟生理功能，但不适合中高通量研究和体外基因操作；细胞系模型缺乏 cTEC 和 mTEC 特异性分子机制，无法支持胸腺基质功能的研究 。因此，开发一种能模拟天然胸腺、适用于中高通量分析的体外胸腺模型迫在眉睫。

微型胸腺类器官（mTOs）的构建与验证

为了构建新的胸腺模型，研究人员开发了基于高密度微孔阵列的微型胸腺类器官（mTOs）。在构建过程中，他们首先测试了不同发育阶段的胎儿胸腺细胞在微孔板中的聚集情况，发现将两个胸腺叶（即一个胚胎等效）的细胞接种到含有 31 个 800-μm 直径微孔的单个孔中效果最佳。通过对胚胎日 13.5（E13.5）、E14.5 和 E15.5 的胎儿胸腺细胞进行实验，发现这些细胞在接种后能迅速形成细胞聚集体，并在 48 小时内形成清晰的球状结构，且该结构能在培养中持续至少 14 天。其中，E14.5 的 mTO 在胸腺细胞亚群分布上与 FTOC 和标准 RFTOC 相似，因此被用于后续的所有分析。

接着，研究人员确定了构建功能性 mTO 所需的最小细胞输入。通过 “Watch-breaker” 实验，他们将 E14.5 的胸腺细胞分离为 TECs、胎儿胸腺间充质（FTM）、造血细胞（CD45⁺）和内皮细胞（EC）等群体，然后分别测试不同细胞组合对 mTO 功能的影响。结果发现，FTM 是 mTO 形成所必需的，缺乏 FTM 时，胸腺细胞发育无法超越双阴性（DN）阶段；而 T 细胞发育在 mTO 中并不需要胸腺 ECs。此外，研究还优化了输入胸腺细胞的数量，确定了最佳的细胞比例，即 1×10⁵个 TECs、5×10⁴个 DNs 和 4×10⁴个 FTMs。

为了进一步验证 mTOs 的功能，研究人员测试了其支持未成熟造血祖细胞分化的能力。他们用 E14.5 胎儿肝脏淋巴样启动多能祖细胞（LMPPs）替代 DN 细胞，结果发现 mTOs 能够支持 LMPPs 的胸腺生成，尽管其分化动力学比 DN 细胞延迟，但生成的 DP、SP4、SP8 和 γδ 胸腺细胞数量更多。同时，研究人员还分析了 mTOs 中 T 细胞发育的动力学，发现 7 天的培养期能产生最多的发育中 T 细胞，且实验间变异最小，因此被选为进一步分析的时间点。

mTOs 的结构与细胞组成分析

研究人员对 mTOs 中基质细胞的组织和身份进行了评估。通过使用两种报告基因小鼠品系（Foxn1^GFP和 Rank-Venus;Cxcl12dDsRed），他们发现 mTOs 中存在明显的 cTEC 和 mTEC 区域，且这些区域在空间上是隔离的。通过免疫染色，研究人员检测到了 cTEC 和 mTEC 的标记物，如 DLL4、β5t、CD205、K8、K14、AIRE、MHCI 和 MHCII 等的表达，表明 mTOs 中包含了具有功能的 cTEC 和 mTEC。此外，FTM 细胞和 CD45⁺细胞也存在于 mTOs 中，且 FTM 细胞呈现出两种分布模式。

为了深入了解 mTOs 的细胞复杂性和表型，研究人员进行了单细胞 RNA 测序分析（scRNA-seq）。他们设置了九种 “Watch-breaker” 条件，包括 FTOC、RFTOC 等，对不同条件下的细胞进行测序和分析。结果发现，mTOs 包含了所有主要的 TEC 亚型，尽管与早期产后胸腺相比，mTECII 的相对代表性较低，但每个亚型都表达了预期的标记物，且表达水平 “正常”。与 FTOC 和 RFTOC 相比，mTOs 中最显著的差异是 Aire⁺ mTECII 的相对较少，以及 MHC 基因和干扰素（IFN）靶标的表达略低 。此外，研究还发现了 FTM 对 TEC 基因表达的影响，以及不同培养条件（如浸没培养）对基因表达的影响。

mTOs 的作用机制及意义

通过比较有 FTM 和无 FTM 的 mTO，研究人员发现 FTM 在 TEC 的分化和维持中起着重要作用。在无 FTM 的 mTO 中，许多 TEC 标记物的表达显著降低，包括 MHCI、MHCII、Aire、Fezf2 等，同时 IFN 信号通路和抗原加工呈递通路也被下调。这表明 FTM 可能通过调节 IFN 信号通路来影响 TEC 的发育和功能。

mTOs 的出现为胸腺生物学的研究提供了一个重要的平台。它满足了功能性胸腺类器官的标准，能够支持 T 细胞的谱系定向和分化，生成成熟的 SP4 和 SP8 T 细胞。与现有的模型相比，mTOs 具有诸多优势，如每个微孔板的孔中可包含多个 mTOs，能在最小的输入细胞数量下进行多次重复实验；可进行实时成像，便于分析器官 oid、TEC 和 / 或胸腺细胞的行为。此外，mTOs 还可用于探索胸腺微环境中细胞间的相互作用，为研究胸腺发育、免疫缺陷疾病和癌症免疫疗法提供了新的工具。

尽管 mTOs 具有很大的潜力，但目前该研究也存在一定的局限性。实验间的可变性是主要问题之一，这与其他体外胸腺模型类似。不过，随着实验技术的不断改进和操作人员经验的增加，这种可变性有望降低。未来，mTOs 有望进一步发展，例如通过整合体外生成或扩增的 TECs，使其更适用于遗传操作和建模，以及高通量筛选协议，为胸腺相关疾病的治疗和研究带来新的突破。