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志贺菌（Shigella）是导致中重度腹泻的主要病原菌，严重威胁贫困地区儿童健康。本文通过对马里和埃塞俄比亚等流行地区 6 个月至 2 岁儿童的研究，分析其对志贺菌的体液免疫反应，发现儿童抗体水平随年龄和地区而异，12 - 17 个月龄儿童最为易感，为疫苗设计提供关键依据。
引言
志贺菌（Shigella）每年在全球导致超过 60,000 名 5 岁以下儿童死亡，反复感染会引发营养不良、生长发育迟缓以及免疫和认知发展缺陷等严重后果。开发一款安全、有效且价格亲民的志贺菌疫苗，对于改善低资源环境下儿童的健康状况意义重大。
儿童感染志贺菌的风险在 5 岁前呈钟形曲线分布。0 - 11 个月大的婴儿感染风险较低，12 - 23 个月龄时疾病发病率达到峰值，随后在 24 - 59 个月龄逐渐下降。与之相反，婴儿出生时具有较高水平的母体来源抗志贺菌抗体，这些抗体在出生后第一年逐渐减少，从而形成一个易感染窗口期，此时恰好是感染发病率最高的时期。之后，随着年龄增长和接触志贺菌，儿童逐渐获得免疫保护。
目前，人们对幼儿志贺菌免疫的发展了解有限。以往研究多聚焦于志贺菌脂多糖（LPS）和特定血清型，而对保守志贺菌蛋白抗体的分析相对滞后。在本研究中，研究人员开发了一种基于 Meso Scale Discovery（MSD）平台的多重免疫分析方法，能够同时定量 9 种志贺菌抗原，包括入侵蛋白（Ipa）B、IpaC、IpaD、IpaH、毒力蛋白 VirG，以及代表主要流行血清型的 LPS 抗原，如福氏志贺菌（S. flexneri）2a、3a、6 型和宋内志贺菌（S. sonnei）。
结果
- 分析方法的建立与验证
- 优化分析条件：利用 MSD 技术开发了同时检测多种志贺菌抗体的多重分析方法，确定了最佳抗原包被浓度，选择合适的分析试剂和条件，以提高特异性信号和动态范围。
- 建立内部标准曲线：在国际志贺菌血清学标准尚未建立的情况下，研究人员建立了自己的 IgG 和 IgA 内部标准。IgG 内部标准来自流行地区成人的高滴度血清池，IgA 内部标准则是来自同一地区哺乳期妇女的母乳。通过改良的 Zollinger 方法确定了抗体浓度，标准曲线显示出良好的线性和较宽的动态范围。
- 确定定量限：根据标准曲线确定了每种抗体特异性的检测下限（LLOD）和定量下限（LLOQ），未设定定量上限（ULOQ），对于信号超出 ULOD 的样本，将进行更高倍数稀释后重新检测。
- 分析特异性：通过结合抑制实验评估分析方法检测目标抗原特异性抗体的能力。结果表明，该方法对大多数抗原具有较高的特异性，IgG 分析中除 VirG 外，其他抗原的抑制率均超过 80%；IgA 分析中所有抗原的抑制率均超过 92%。
- 线性和准确性验证：通过对模拟样本和系列稀释样本的分析，验证了该方法的线性和准确性。结果显示，计算得到的 IgG 和 IgA 浓度与预期浓度之间具有良好的线性关系，抗体回收率在可接受范围内，分析方法具有较高的准确性和精密度。
- 稳健性测试：评估常见实验变化对分析方法的影响，结果表明该方法在不同的洗板方式和孵育时间下表现稳健，不受这些小的有意变化的影响。
- 不同地区人群志贺菌抗体的血清流行率
- 成人血清流行率：对美国、马里和马拉维的成人血清进行检测，发现马里和马拉维等流行地区的成人对所有抗原的 IgG 水平显著高于美国成人，表明环境接触会影响抗体水平。
- 儿童血清流行率：对马里和埃塞俄比亚三个流行地区 6 个月至 2 岁儿童的血清进行检测，发现儿童的抗体水平和血清流行率模式因年龄和地理位置而异。6 - 8 个月龄的儿童中，除了针对某些 LPS 抗原的 IgG 水平在不同地区存在差异外，其他抗体水平在各地区间相似。12 - 17 个月龄和 18 - 24 个月龄的儿童中，来自埃塞俄比亚阿法尔地区的儿童抗体水平普遍高于其他地区。此外，儿童血清 IgA 水平也随年龄增长而增加，且在不同地区间存在差异。与破伤风抗毒素（TT）的血清 IgG 动力学不同，志贺菌抗体水平在儿童 1 - 2 岁期间呈上升趋势，证实其与接触志贺菌有关。
- 儿童志贺菌抗体反应的广度：通过绘制 LPS 抗体水平的广度 - 效价曲线，发现 18 - 24 个月龄的儿童具有最广泛的 LPS IgG 和 IgA 抗体谱。不同地区的抗体广度存在差异，阿法尔地区的 LPS IgG 广度效价随年龄增长而增加，而提格雷地区则保持不变；在巴马科，LPS IgG 广度效价在 18 - 24 个月龄儿童中有所增加。LPS IgA 的广度在所有地区均随年龄增长而增加。
- 志贺菌抗原特异性抗体之间的关联：蛋白质特异性 IgG 滴度在各年龄组和地理分布中大多呈强相关，但 IpaD 在某些情况下除外。LPS IgG 抗体之间的关联因年龄组和地区而异。6 - 8 个月龄儿童中，LPS IgG 与蛋白质特异性 IgG 的关联普遍较弱；在阿法尔和提格雷地区，随着年龄增长，这种关联有所改善，但在提格雷地区 18 - 24 个月龄儿童中，宋内志贺菌 LPS IgG 与其他抗原的关联较低。在巴马科，LPS IgG 与其他抗原的关联在所有年龄组中均较弱，仅福氏志贺菌 2a LPS 与某些蛋白质抗原的关联较强。抗原特异性 IgA 滴度之间的关联在不同抗体特异性和地理区域之间没有明显规律。
- 年龄和地理因素对体液免疫的影响：将儿童的 IgG 和 IgA 滴度与成人受控人类感染模型（CHIM）研究中确定的临床保护阈值进行比较，发现不同年龄组和地区的儿童达到保护阈值的比例不同。6 - 8 个月龄儿童中，部分地区的儿童由于母体获得的抗体，其 IpaB 和 VirG IgG 水平高于保护阈值，但在其他地区则低于阈值。12 - 17 个月龄的儿童中，巴马科和提格雷地区的大多数儿童 IpaB 和 VirG IgG 水平低于保护阈值。18 - 24 个月龄时，大多数地区的儿童 IpaB 和 VirG IgG 水平超过保护阈值，阿法尔地区的比例最高。宋内志贺菌 LPS IgG 和 IgA 的阈值更为严格，大多数儿童的水平低于保护阈值，但 18 - 24 个月龄儿童中，提格雷地区有 54% 的儿童宋内志贺菌 LPS IgG 水平高于阈值。总体而言，随着年龄增长，达到保护阈值的儿童比例增加。
讨论
本研究开发并验证了一种基于 MSD 平台的多重电化学发光分析方法，该方法能够高效、准确地同时定量多种志贺菌抗体。与以往的分析方法相比，它具有更高的灵敏度、更宽的动态范围以及更好的准确性和精密度，且所需样本量少。
研究发现，不同地区人群的志贺菌抗体水平存在显著差异，流行地区人群的抗体水平更高，这与环境接触密切相关。在儿童中，年龄和地理区域对志贺菌抗体水平和血清流行率模式有重要影响。6 - 8 个月龄儿童的 IgG 水平反映了母体的体液免疫，不同地区间的相似性表明胎盘转移和抗体随时间下降的过程具有普遍性。随着年龄增长，地理区域的影响逐渐显现，巴马科地区儿童的 IgG 水平在 12 - 17 个月龄时下降，18 - 24 个月龄时上升，这与母体保护的减弱和腹泻发作次数的增加有关。阿法尔地区儿童的抗体水平较高且发展更快，这可能与该地区的生活方式和卫生条件有关，该地区居民主要为游牧民族，更容易接触到食源性和水源性病原体。
本研究不仅检测了 LPS 抗体，还对血清 IgG 和 IgA 抗体针对志贺菌蛋白抗原进行了分析。血清 IgA 水平在 1 - 2 岁儿童中稳步上升，与该年龄段较高的志贺菌感染发病率一致，表明其可能是志贺菌早期接触的独特生物标志物。12 - 24 个月龄儿童中，蛋白质特异性 IgG 和 IgA 之间存在强关联，LPS 特异性 IgG 和 IgA 之间的关联在 18 - 24 个月龄时有所改善，这表明不同类型抗原诱导的免疫反应存在差异，且蛋白质和 LPS 特异性抗体在保护中发挥不同但互补的作用。
尽管本研究取得了重要进展，但仍存在一些知识空白，例如自然获得性免疫预防志贺菌感染的精确抗原靶点、诱导的抗体类型、从婴儿期到成年期的免疫发展过程、抗体的持久性和增强刺激因素，以及免疫作用的位点和功能机制等。在缺乏明确的保护性免疫指标的情况下，本研究利用 CHIM 研究数据确定了与临床保护相关的抗体阈值，但这些结果只能反映暴露的血清学情况，不一定代表保护性免疫。未来需要开展前瞻性研究，结合对志贺菌感染的主动监测和深入的免疫学研究，以确定 3 岁以下儿童的保护性免疫相关指标，这对于理解自然获得性免疫和预测疫苗疗效至关重要。此外，缺乏校准标准限制了血清学检测的发展，建立国际校准标准将有助于标准化样本检测和加速疫苗评估。
综上所述，本研究开发的多重分析方法为志贺菌血清流行病学研究、疫苗和 CHIM 研究中的免疫反应评估，以及疫苗引入和有效性评估提供了有力工具。通过对 6 个月至 2 岁儿童血清学特征的分析，揭示了流行病学趋势，并确定 12 - 17 个月龄儿童为最易感人群。年长且不易感儿童中志贺菌蛋白特异性抗体水平的增加，进一步证实了这些蛋白作为疫苗候选抗原的潜力。
