揭秘 AUP1 与 UBE2G2 复合体：调控病毒免疫反应的关键 “开关”

本文聚焦于干扰素基因刺激蛋白（STING）信号通路，研究发现古老普遍蛋白 1（AUP1）与 UBE2G2 复合体可靶向 STING，抑制其在静息状态下的激活，且 AUP1 还能调节脂质代谢影响病毒复制，为抗病毒治疗和自身免疫病治疗提供新思路。

　　

引言

干扰素基因刺激蛋白（STING）是 cGAS-STING 通路中的关键信号衔接蛋白，在静息状态下定位于内质网（ER）膜。当病原体来源的胞质双链 DNA（dsDNA）被环鸟苷酸 - 腺苷酸合成酶（cGAS）识别后，cGAS 催化产生第二信使环磷酸鸟苷 - 腺苷酸（cGAMP），cGAMP 与 STING 结合，触发其构象变化并激活。激活后的 STING 从内质网转位到高尔基体，招募 TANK 结合激酶 1（TBK1）和干扰素调节因子 3（IRF3），进而诱导 I 型干扰素（IFNs）和促炎细胞因子的表达，介导先天抗病毒免疫和炎症反应 。

然而，STING 的异常激活与自身免疫性疾病相关，如 Aicardi–Goutieres 综合征、系统性红斑狼疮等 I 型干扰素病，以及婴儿期发病的 STING 相关血管病变（SAVI）等。因此，精确调控 STING 的激活对维持免疫稳态至关重要，但目前其静息状态的维持机制尚不清楚。

古老普遍蛋白 1（AUP1）定位于内质网和脂滴（LDs），已有研究表明它与 STING 可能存在相互作用，且 AUP1 含有与 E2 泛素结合酶 G2（UBE2G2）结合的结构域，UBE2G2 作为 AUP1 的辅助因子，其蛋白稳定性受 AUP1 调控，同时人 STING 也可能与 UBE2G2 相互作用，但 AUP1-UBE2G2 复合体在 STING 生物学中的作用尚未被探究。

结果

1. AUP1 基因敲除增强 cGAS-STING 信号通路：运用 CRISPR-Cas9 基因编辑技术敲除 HeLa 细胞中的 AUP1，用 cGAS 激动剂鲱鱼精 DNA（HT-DNA）刺激后，与野生型 HeLa 细胞相比，AUP1 敲除细胞中 IFNB1 和干扰素刺激基因（ISGs）的 mRNA 表达水平显著升高。用短发夹 RNA（shRNA）敲低 AUP1 表达也得到类似结果。此外，AUP1 敲除细胞经 HT-DNA 刺激后，TBK1、IRF3、STING 以及 JAK/STAT 通路下游蛋白 STAT1 和 STAT2 的磷酸化水平显著增强，而对 MDA5 和 RIG-I 激动剂聚肌胞苷酸（poly (I:C)）诱导的信号通路无明显影响，表明 AUP1 基因敲除特异性调节 cGAS-STING 信号通路。
2. AUP1 与 STING 相互作用：通过免疫共沉淀实验证实，外源性 Flag-STING 与外源性 V5-AUP1 在 HEK293T 细胞中相互作用，内源性的 STING 与 AUP1 在 HeLa 细胞中也存在相互作用，共聚焦显微镜显示 STING 与 Flag-AUP1 共定位。进一步的截短实验表明，AUP1 的多个功能区域和 STING 的不同结构域均参与了二者的相互作用，通过三维结构模型和对接模拟确定了参与相互作用的关键氨基酸残基。而且，HT-DNA 刺激后，AUP1 与 STING 的相互作用减弱。
3. AUP1 基因敲除促进 STING 信号传导：在静息状态下，AUP1 缺陷的 HeLa 细胞中 IFNB1、IFIT1、ISG15 和 CXCL10 等炎症细胞因子的转录水平显著增加，敲低 AUP1 也导致类似结果，重新引入野生型 AUP1 可降低这些基因的表达。用 STING 激动剂 diABZI 刺激细胞后，AUP1 敲除的 HeLa 细胞和敲低的 THP1 细胞中 IFNB1 和 ISGs 的 mRNA 水平明显高于对照细胞，同时 p-TBK1 和 p-STING 水平增加，信号传导时间延长，表明 AUP1 可能通过作用于 STING 调节先天免疫反应。
4. UBE2G2 是 AUP1 调节 STING 信号所必需的：作为 AUP1 的辅助因子，UBE2G2 与 AUP1 密切相关。实验表明，UBE2G2 不仅与 AUP1 相互作用，还与 STING 相互作用，AUP1 敲低会使 UBE2G2 蛋白更不稳定。在静息状态下，AUP1 对 ISGs 的调节可能需要 UBE2G2 的参与，敲低 UBE2G2 可增强 HT-DNA 刺激诱导的 IFNB1 和 ISGs 的 mRNA 表达，且这种增强作用依赖于 STING。
5. 敲低 UBE2G2 激活 STING 信号和自噬：在静息状态下，UBE2G2 敲低的 HeLa 细胞中 ISGs 的表达显著增加，重新引入野生型 UBE2G2 或其催化缺陷型突变体（C89K）可使 ISGs 表达恢复到野生型水平。用 diABZI 刺激后，UBE2G2 敲低显著增强下游基因的转录，敲低 STING 可逆转这一效应。此外，敲低 UBE2G2 还能增强 STING 诱导的自噬，表现为 LC3 脂化增加，敲低 STING 后这种增加被消除。
6. 在小鼠细胞中敲低 Ube2g2 增强 STING 介导的先天免疫反应：在小鼠 L929 细胞中用慢病毒感染携带 shRNA 敲低 Ube2g2，结果显示，敲低 Ube2g2 在无刺激时显著增加 ISGs 的转录，用 HT-DNA 或 2′,3′-cGAMP 刺激后，Ifnb1、Ifit1、Isg15 和 Cxcl10 的诱导表达显著增加，TBK1 的磷酸化水平也明显增强，表明 UBE2G2 在小鼠细胞系中对 STING 调节的先天免疫反应起关键作用。
7. AUP1 和 UBE2G2 将 STING 保留在内质网：STING 信号与内质网应激和未折叠蛋白反应（UPR）有关，AUP1 参与内质网相关降解（ERAD）途径。但研究发现，AUP1 敲低对 UPR 相关蛋白肌醇需求酶 1α（IRE1α）和剪接的 XBP1 mRNA 水平无显著影响，抑制 IRE1α 活性也不影响 AUP1 敲低细胞中 ISGs 的转录水平，说明 AUP1 对 STING 通路的影响独立于 UPR 和 IRE1α。用布雷菲德菌素 A（BFA）处理可阻断 STING 从内质网的转位，结果显示 BFA 能降低 AUP1 敲低的 HeLa 细胞或 UBE2G2 敲低的 THP1 细胞中 ISGs 的转录，证实 AUP1 和 UBE2G2 在静息状态下可将 STING 保留在内质网，抑制其下游信号激活。
8. AUP1 缺陷增强 DNA 病毒触发的信号并抑制病毒体内外复制：DNA 病毒感染可激活 cGAS-STING 信号通路。研究发现，AUP1 敲除的 HeLa 细胞感染痘苗病毒（VACV）或单纯疱疹病毒 1 型（HSV-1）后，IFNB1 和 IFIT1 的 mRNA 诱导表达显著增加，TBK1 的磷酸化水平升高，病毒复制明显受到抑制。在体内实验中，用携带 shRNA 的腺相关病毒 9 型（AAV9）抑制小鼠体内 Aup1 的表达，感染 HSV-1 后，小鼠脾脏和肺中 Ifnb1 和 Cxcl10 的产生增加，HSV-1 的 mRNA 水平降低，血清中 IFN-β 的蛋白水平升高，表明 Aup1 缺陷可增强 DNA 病毒诱导的先天免疫反应并限制病毒感染。此外，AUP1 敲除对 RNA 病毒水泡性口炎病毒（VSV）的复制也有抑制作用，但与 IFN 信号通路无关。
9. VSV 感染上调 AUP1 并通过调节脂质积累影响其复制：AUP1 是脂滴蛋白，VSV 感染可使 AUP1 蛋白水平逐渐积累，但不影响其 mRNA 水平，敲低 AUP1 显著抑制 VSV 复制。免疫荧光实验显示，AUP1 敲低细胞中脂质积累减弱，且 AUP1 可调节脂质代谢基因如肉碱棕榈酰转移酶 1A（CPT1A）、单甘酯脂肪酶（MGLL）和固醇调节元件结合转录因子 1（SREBF1）的表达。过表达 CPT1A 或 MGLL 可显著抑制 VSV 复制，用 SREBF1 抑制剂 AM580 处理细胞后再感染 VSV，VSV 的 mRNA 和蛋白水平降低，说明 AUP1 可通过调节脂质代谢影响病毒复制。

讨论

STING 的异常激活可能导致免疫紊乱和自身免疫性疾病，维持其静息状态对免疫稳态至关重要。本研究发现 AUP1-UBE2G2 复合体是 STING 先天免疫的关键抑制因子。AUP1 通过与 STING 的多个功能区域相互作用，主要结合其跨膜区域，将 STING 保留在内质网，抑制其在静息状态下的激活，从而调节先天免疫反应。

UBE2G2 作为 AUP1 的辅助因子，可能通过加强 AUP1 与 STING 的相互作用，在静息状态下将 STING 锚定在内质网，但具体机制尚不清楚。此外，AUP1 缺陷不仅增强了 DNA 病毒诱导的先天免疫反应，还抑制了 RNA 病毒 VSV 的复制，这可能与 AUP1 调节脂质代谢有关。VSV 感染导致 AUP1 蛋白积累，AUP1 可调节脂质代谢基因，影响脂质积累，进而影响病毒复制。

综上所述，本研究揭示了 AUP1 在 STING 信号通路和脂质代谢通路中的重要作用，为增强抗病毒治疗和治疗自身免疫性疾病提供了新的策略和理论依据。