双特异性抗体抗击克里米亚 - 刚果出血热病毒：亲和力与可变结构域间距的关键作用，开启治疗新征程

本文聚焦克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV），当前尚无获批疫苗和疗法。研究人员对双特异性抗体（bsAb）DVD - 121 - 801 进行改造，探究其可变结构域间距和亲和力对中和、融合抑制及体内保护效果的影响，发现 DVD - 121 - 801GS保护效果更佳，为治疗 CCHFV 感染提供新方向。

　　

研究背景

克里米亚 - 刚果出血热病毒（CCHFV）是一种广泛分布于欧洲、非洲和亚洲的蜱传病毒，属于布尼亚病毒科内罗毕病毒属，其基因组由三个片段组成，编码多种蛋白，其中糖蛋白前体复合物（GPC）经加工产生的 Gn 和 Gc 在病毒进入细胞过程中发挥关键作用。

CCHFV 感染人类后，多数通过蜱叮咬或接触感染牲畜传播，可引发非特异性发热性疾病，严重时进展为出血热，病死率高达 30% - 40%。目前，尚无经美国食品药品监督管理局（FDA）或欧洲药品管理局（EMA）批准的疫苗和疗法。

此前研究发现，针对 CCHFV 表面糖蛋白 Gn 和 Gc 的抗体疗法颇具前景。研究人员从乌干达 CCHFV 康复者体内分离出多种单克隆抗体（mAbs），其中针对 Gc 的 ADI - 36121 和 ADI - 37801 单克隆抗体，单独使用时就有较强中和能力，联合使用呈协同效应。将二者的可变片段（Fvs）连接成双特异性抗体（bsAb）DVD - 121 - 801 后，其中和效力显著提升，在致死性 CCHFV 小鼠模型中，该双特异性抗体在感染后 1 天治疗仍能保护 80% 的小鼠存活，但 DVD - 121 - 801 活性增强的分子机制尚不清楚。

实验设计

1. 双特异性抗体设计：针对 ADI - 37801 的 V_H结构域中可能影响活性的半胱氨酸（Cys49）和丝氨酸（Ser60）进行定点突变，将其回复为胚系状态，构建新的 DVD - 121 - 801。同时，设计一系列 “121 - 仅变体”，包括串联重复 ADI - 36121 Fv 的 DVD - 121 - 121，以及通过突变或替换 Fv 使 “121” 活性缺失的 DVD - 121 - 121x、DVD - 121x - 121 和 DVD - 121 - F4。此外，为探究 Fv 间距对抗体活性的影响，设计两种 “连接子变体” DVD - 121 - 801^SVF和 DVD - 121 - 801^GS，分别延长原连接子或替换为甘氨酸 - 丝氨酸连接子。
2. 实验方法
   • 细胞培养：使用多种细胞系，如非洲绿猴肾细胞系 Vero 和 VeroE6、稳定表达 T7 RNA 聚合酶的金黄地鼠肾细胞系 BSR - T7、中国仓鼠卵巢细胞系 ExpiCHO - S 等，在相应培养基中培养并维持细胞生长。
   • 病毒制备：选用多种临床相关的 CCHFV 分离株，如 CCHFV - IbAr10200、CCHFV - Oman、CCHFV - Hoti、CCHFV - Turkey、CCHFV - Afg09 和 CCHFV - M18 - China 等，用于后续实验。
   • 抗体表达与纯化：构建表达各种单克隆抗体和双特异性抗体的载体，转染 ExpiCHO 细胞表达抗体，利用蛋白 A 树脂进行纯化，随后进行缓冲液置换和浓缩。
   • 结合特性分析：采用生物层干涉技术（Biolayer Interferometry）检测抗体与 CCHFV IbAr10200 重组生物素化 Gn/Gc 的结合和解离特性。
   • 病毒样颗粒（VLP）制备：通过转染 BSR - T7 细胞，使其共表达 CCHFV 的 NP、GPC、聚合酶（L）、T7 聚合酶和 Nano - Glo 荧光素酶微型基因组，制备携带 CCHFV 糖蛋白的转录和进入能力的病毒样颗粒（tecVLPs）。
   • 中和实验：分别使用 tecVLPs 和真实病毒进行中和实验。在 tecVLP 中和实验中，将抗体与 tecVLPs 孵育后感染 Vero 细胞，通过检测荧光素酶活性评估感染情况；在真实病毒中和实验中，将抗体与病毒孵育后感染 VeroE6 细胞，固定染色后利用成像仪器检测感染细胞比例，计算半数抑制浓度（IC₅₀）评估中和活性。
   • 融合抑制实验：利用携带 CCHFV - Oman GPC 的 tecVLPs 进行融合抑制实验。先使 tecVLPs 与细胞在 4°C 结合，再用不同 pH 值的融合培养基触发融合，添加氯化铵（NH₄Cl）抑制内体 / 溶酶体途径的融合，检测抗体对融合的抑制作用，计算曲线下面积（AUC）评估抑制效果。
   • 动物实验：选用 1 型干扰素 α/β 受体敲除（IFNAR1^?/?）小鼠，腹腔注射感染不同剂量的 CCHFV 分离株，感染后 1 天腹腔注射 1mg 双特异性抗体或等量 PBS，每天观察小鼠临床症状和发病情况，根据评分标准进行评分，记录体重变化，直至实验结束。
   • 稳定性实验：将纯化后的抗体在特定配方中浓缩，添加 PS80 后分别在 4°C 和 40°C 储存，定期取样通过尺寸排阻色谱分析抗体稳定性。
   
   

实验结果

1. 双特异性抗体设计验证：通过生物层干涉实验表明，新设计的连接子变体 DVD - 121 - 801^SVF和 DVD - 121 - 801^GS的 Fv 结合功能未受影响，能够与重组 Gn/Gc 正常结合。
2. 中和实验结果
   • tecVLPs 中和实验：多数双特异性抗体的中和活性相似，连接子的改变对中和活性影响不大。但 DVD - 121 - 121x 和 DVD - 121x - 121 的中和效力降低，其 IC₅₀值分别比 DVD - 121 - 801 和 DVD - 121 - 121 高 2.5 倍和 10 倍，表明双特异性抗体的价态与中和效力相关。此外，DVD - 121 - F4 的 IC₅₀值与亲本抗体相似，提示外部 Fv 对中和作用贡献更大。“原始” 的 ADI - 37801^C49中和效力显著强于胚系回复变体，但 DVD - 121 - 801^C49和 DVD - 121 - 801 的中和活性无显著差异。所有检测的双特异性抗体对 tecVLPs 的 IC₅₀值均小于 1nM，显示出较强的中和能力。
   • 真实病毒中和实验：针对多种 CCHFV 分离株的中和实验呈现相似趋势。DVD - 121 - 801 对所有检测分离株均有强效中和作用（IC₅₀ < 1nM），明显优于单克隆抗体 ADI - 36121 和 ADI - 37801 单独或联合使用。连接子变体 DVD - 121 - 801^GS和 DVD - 121 - 801^SVF与亲本抗体中和能力相似。DVD - 121 - 121 也能有效中和所有分离株，暗示 “801” Fv 可能并非必需。而缺乏功能性 Fv 的 “121 - 仅变体”（DVD - 121 - 121x、DVD - 121x - 121）对所有分离株的中和 IC₅₀值显著升高，表明亲和力对中和效力贡献显著。不同分离株对抗体中和的敏感性存在差异，所有检测抗体对 IbAr10200 和 M18 - China 分离株的中和效果比对其他分离株或 tecVLPs 高一个数量级。
   
   
3. 融合抑制实验结果：在融合抑制实验中，ADI - 36121 能够抑制融合，DVD - 121 - 801 在较低浓度下抑制融合，但与 ADI - 36121 相比差异无统计学意义。ADI - 37801 即使在 350nM 的高浓度下也不能抑制融合。具有两组功能性 Fv 的双特异性抗体（DVD - 121 - 801^GS、DVD - 121 - 801^SVF、DVD - 121 - 121）与亲本抗体的融合抑制 AUC 值无显著差异，而含有一组非功能性 Fv 的双特异性抗体（DVD - 121 - 121x、DVD - 121x - 121、DVD - 121 - F4）融合抑制效果与 ADI - 36121 或亲本抗体相当或更差，表明内外结构域均具有功能性 Fv 对于最佳抑制病毒膜融合至关重要。
4. 动物实验结果
   • CCHFV - IbAr10200 感染模型：在致死性 CCHFV - IbAr10200 小鼠感染模型中，所有接受双特异性抗体治疗的小鼠生存率均显著提高（除 DVD - 121 - 121 外），其中接受 DVD - 121 - 801^GS治疗的小鼠生存率最高，达 50%，且疾病症状较轻。
   • 多种 CCHFV 分离株感染模型：针对 CCHFV - Turkey、CCHFV - Afg09 和 CCHFV - M18 - China 分离株的感染实验中，亲本分子 DVD - 121 - 801 对所有分离株均有一定保护作用，生存率为 50% - 70%。DVD - 121 - 121 对 CCHFV - Turkey 和 CCHFV - M18 - China 的保护效果显著，生存率分别达 100% 和 70%，对 CCHFV - Afg09 虽无生存保护，但可显著延迟死亡时间。DVD - 121 - 801^SVF对 CCHFV - Turkey 的保护效果不显著，但可延迟 CCHFV - Afg09 和 CCHFV - M18 - China 感染小鼠的发病时间。DVD - 121 - 801^GS治疗能显著降低小鼠体重减轻和疾病临床症状，对所有检测的 CCHFV 分离株均有显著保护作用，生存率分别为：CCHFV - Turkey 90%、CCHFV - Afg09 30%、CCHFV - M18 - China 60%。
   
   
5. 稳定性实验结果：稳定性实验表明，亲本 DVD - 121 - 801 和 DVD - 121 - 801^GS在 4°C 储存时降解极少，在 40°C 储存时虽有一定降解，但即使长时间加热后仍有超过 85% 的样品保持单体形式，显示出良好的稳定性和开发潜力。
6. 亲和力对保护作用的影响：尽管 DVD - 121 - 121x 和 DVD - 121x - 121 仅有一组功能性 Fv 结构域，但仍有较强中和能力。然而，在针对 CCHFV - IbAr10200 的保护效力实验中，接受这两种抗体治疗的小鼠迅速体重下降、疾病评分高，均在感染后 5 天内死亡，而接受其他具有更高亲和力的双特异性抗体（如 DVD - 121 - 801、DVD - 121 - 121）治疗的小鼠生存率显著提高，表明亲和力在双特异性抗体的保护作用中起关键作用。

研究讨论

双特异性抗体是抗病毒治疗的有前景的手段。DVD - 121 - 801 的两个 Fv 分别靶向 CCHFV Gc 的两个保守抗原位点，理论上具有广泛反应性。此前研究生成多种双特异性抗体，仅 DVD - 121 - 801 能保护小鼠免受致死性攻击。结构研究发现，Gn 上的 N - 连接聚糖可能掩盖病毒融合环，影响抗体结合。ADI - 37801 靶向融合环抑制 Gc 三聚体插入，ADI - 36121 靶向结构域 II 三聚化界面，二者协同发挥作用。

延长 “121” 和 “801” Fv 之间的连接子生成的 DVD - 121 - 801^SVF和 DVD - 121 - 801^GS，在中和及融合抑制方面与亲本抗体无差异，但在体内实验中，DVD - 121 - 801^GS对多种分离株的保护效果显著优于 DVD - 121 - 801^SVF，可能是由于其甘氨酸 - 丝氨酸连接子的灵活性，使其能更好地结合并克服病毒表面差异，而 DVD - 121 - 801^SVF连接子的庞大侧链可能阻碍协同结合。

“121 - 仅变体” 实验表明，增加 “121” Fv 的价态可克服 Fv 定位要求，增强对病毒的中和及保护作用，进一步证明亲和力在靶向 CCHFV Gc 中的重要性。病毒中和效力在一定程度上可预测双特异性抗体的体内保护效果，但血清半衰期或 Fc 效应子功能等因素也可能影响保护机制。

研究鉴定出第二代双特异性抗体 DVD - 121 - 801^GS，在实验中对多种 CCHFV 分离株具有最佳的交叉保护效果，且稳定性较好。尽管其保护效果存在分离株依赖性差异，但对所有检测分离株均有显著保护作用。未来可通过进一步优化抗体 Fc 区域或联合靶向 GP38 的单克隆抗体等方式，进一步提高治疗效果。DVD - 121 - 801^GS适合在大型动物模型中进行评估，为 CCHFV 感染的治疗提供了新的希望。