HIV-1衣壳蛋白M66I突变对Lenacapavir耐药的结构与机制研究及其对病毒复制的影响

这篇研究揭示了HIV-1衣壳蛋白（CA）M66I突变通过空间位阻效应显著降低Lenacapavir（LEN）结合亲和力的分子机制，同时保留与宿主因子（CPSF6/NUP153/SEC24C）的相互作用。通过高分辨率X射线晶体学、生化及病毒学实验，发现M66I突变导致病毒核导入缺陷和整合靶向改变，为开发抗耐药第二代CA抑制剂提供了结构基础。

　　

Structural and mechanistic bases for resistance of the M66I capsid variant to lenacapavir

ABSTRACT
Lenacapavir（LEN）是首个靶向HIV-1衣壳蛋白（CA）的抗逆转录病毒药物，用于治疗多重耐药HIV-1感染。临床和细胞实验发现，LEN靶向的CA疏水口袋附近存在耐药相关突变（RAMs），其中M66I突变表现出最强的耐药性。本研究通过高分辨率X射线结构解析发现，Ile66的β-分支侧链通过空间位阻特异性干扰LEN的R3/R4基团，使其解离速率（k_off）增加230倍，而宿主FG-motif蛋白（CPSF6/NUP153/SEC24C）的结合不受影响。病毒学实验显示，HIV-1_{(M66I CA)}虽能形成更稳定的成熟衣壳，但核导入严重受损，导致整合位点向核膜相关区域（LADs）偏移。

INTRODUCTION
HIV-1衣壳由约1,500个CA蛋白组装成锥形结构，其动态稳定性对病毒核导入和免疫逃逸至关重要。LEN通过结合CA六聚体疏水口袋（含Met66）超稳定化衣壳，阻断核导入等关键步骤。临床CAPELLA试验中，M66I是多重耐药患者中最常见的RAM，但其结构机制尚不明确。

RESULTS

1. M66I特异性削弱LEN结合而不影响宿主因子互作

   • SPR显示M66I六聚体的LEN结合亲和力（K_D）下降230倍，主要因k_off显著增加（图1A-B）。
   • 共沉降实验证实CPSF6/NUP153/SEC24C与M66I纳米管结合不受影响（图1C-E）。
   • 晶体结构显示Ile66的γ2碳与LEN的R3/R4基团距离仅2.5-2.7 ?，产生空间冲突（图2A-D），而CPSF6 Phe321仍保持3.5 ?的疏水相互作用（图2E-H）。

2. M66I病毒在细胞培养中难以获得补偿性突变

   • 在SupT1细胞中，HIV-1_{(M66I CA)}仅通过回复突变（Ile66→Met66）恢复复制，且在LEN存在时完全抑制（图3）。

3. 衣壳成熟与稳定性变化

   • TEM显示M66I病毒成熟颗粒比例从82%（WT）降至64%，但体外IP6介导的衣壳样颗粒（CLPs）组装仍以锥形为主（图4）。
   • CypA-DsRed标记实验表明M66I衣壳稳定性提高（t_1/2从6.5 min延长至12.5 min）（图5）。

4. 核导入缺陷与整合靶向改变

   • M66I病毒的2-LTR环水平显著降低，且阿非迪霉素（aphidicolin）处理使其感染性进一步下降（图6F-G），提示NPC穿透障碍。
   • 活细胞成像显示M66I衣壳可稳定停驻核膜（NE）但无法进入核内（图7A-D）。
   • 整合位点分析显示SPADs占比从31%（WT）降至6%，LADs占比增加（图8A-F）。

DISCUSSION
M66I通过β-分支侧链的空间位阻实现LEN特异性耐药，而保留宿主因子结合能力。其核导入缺陷可能与衣壳过度稳定化有关，导致整合靶向偏移至转录抑制区（LADs），潜在影响潜伏库建立。该研究为设计抗耐药CA抑制剂提供了关键结构依据。

MATERIALS AND METHODS
实验方法包括：

• 重组蛋白表达（E. coli BL21-DE3）与SPR结合分析
• 负染TEM观察病毒颗粒形态
• X射线晶体学（ALS Beamline 4.2.2，分辨率见附表1）
• 活细胞共聚焦显微术追踪衣壳动态
• LM-PCR测序整合位点