靶向 IS2404的荧光探针环介导等温扩增技术：布氏溃疡精准诊断的新曙光

本文介绍了一种针对溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）的新型诊断测试 —— 荧光探针环介导等温扩增（P-LAMP）技术，其靶向 IS2404。研究表明，该技术与金标准定量 PCR（qPCR）性能相当，且具有快速、操作简单等优势，为布氏溃疡诊断带来新突破。

　　### 研究背景
布氏溃疡（BU）是一种由溃疡分枝杆菌（Mycobacterium ulcerans）感染引起的被忽视的热带皮肤病。目前，针对溃疡分枝杆菌的金标准分子诊断方法是靶向 IS₂₄₀₄的定量 PCR（qPCR），该方法可产生 59bp 的扩增子，是临床分子诊断和环境监测的主要手段。然而，将其改造成适用于分子实验室外的稳健检测形式的尝试成效有限。世界卫生组织（WHO）已将开发一种便携式、易用的溃疡分枝杆菌诊断测试确定为研究重点，并制定了快速布氏溃疡检测的目标产品概况（TPP），对检测的各项性能提出了要求。

环介导等温扩增（LAMP）技术具有操作简便、灵敏、快速且恒温进行的特点，适合现场检测，因此多个研究小组探索了其检测溃疡分枝杆菌的潜力，但传统 LAMP 方法在特异性和敏感性之间存在权衡。本研究设计并测试了一种使用 TaqMan 式报告探针和锁定核酸（LNA）的 LAMP 检测方法（P-LAMP），以克服传统 LAMP 的一些局限性。

材料和方法

1. 细菌菌株和样本：研究使用了多种细菌菌株，包括溃疡分枝杆菌、其他分枝杆菌以及常见临床病原体等。样本来源广泛，涵盖了负鼠排泄物、负鼠拭子和人类临床样本。其中，负鼠排泄物样本采自澳大利亚特定地区，经标准化方法收集和处理；负鼠拭子样本来自墨尔本和吉朗地区的野生负鼠监测研究；人类临床样本则由澳大利亚维多利亚传染病参考实验室提供。
2. 核酸提取：针对不同样本类型，采用了多种核酸提取方法。如从负鼠排泄物中提取基因组 DNA，可使用 PowerSoil Pro 试剂盒或基于 SPRI 磁珠的提取方法；负鼠拭子样本先在磷酸盐缓冲液中处理，再用基于 SPRI 磁珠的方法提取 DNA；从纯细菌培养物中提取基因组 DNA 时，根据细菌种类的不同，选择相应的试剂盒和预处理方法。
3. IS₂₄₀₄ P-LAMP 检测：利用 LAMP Designer 和 Geneious Prime 软件设计 IS₂₄₀₄ LAMP 的寡核苷酸引物，并设计荧光报告探针。每个 25μL 的 LAMP 反应包含特定的 Master Mix、引物、探针、样本 DNA 等成分。反应在 Mic qPCR Cycler 上进行，65°C 孵育 30 分钟，间隔 30 秒收集 540nm 发射波长（FAM 通道）的数据，使用 Mic PCR 软件进行分析。
4. IS₂₄₀₄ TaqMan qPCR 检测：购买特定引物，反应体系包含 SensiFAST Probe No-ROX mix、引物、探针、TaqMan Exogenous Internal Positive Control（IPC）试剂等。扩增和检测遵循特定程序，在不同平台上进行，根据循环阈值（Ct）判断结果。
5. 统计分析：运用 GraphPad Prism 软件进行数据比较和统计检验。

研究结果

1. P-LAMP 检测设计和计算机分析：设计的常规 LAMP 检测针对 IS₂₄₀₄的 173bp 片段，通过对溃疡分枝杆菌菌株染色体的计算机扫描，验证了引物的特异性。设计的探针包含四个 LNA 碱基，与内部扩增子区域杂交，初步测试显示信号良好且无反应抑制，随后进行检测验证。
2. P-LAMP 与 qPCR 性能比较：对溃疡分枝杆菌基因组 DNA 进行系列稀释检测，P-LAMP 和 qPCR 表现相似，均能检测到 10^-8稀释度的样本。P-LAMP 的检测限（LoD）为 8.33×10^-7ng/μL，约相当于四个基因组拷贝，与 qPCR（约两个基因组拷贝）相当，且二者时间 - 阳性（Tp）值和 Ct 值显著相关。
3. 环境样本检测的一致性：在检测负鼠排泄物样本时，P-LAMP 的敏感性为 95.83%，特异性为 100%；检测负鼠拭子样本时，与 qPCR 的一致性达 100%。
4. 人类临床样本检测的一致性：对 102 份人类临床样本的检测显示，P-LAMP 与 qPCR 的一致性为 100%，敏感性、特异性、阴性和阳性预测值均为 100%。
5. 检测不同来源菌株的能力：P-LAMP 能检测来自不同国家的溃疡分枝杆菌分离株，包括非洲、南美洲以及与鱼类相关的分离株。
6. P-LAMP 的特异性：对多种分枝杆菌和其他细菌的检测表明，P-LAMP 对溃疡分枝杆菌具有高度特异性，未与其他 23 种细菌产生交叉反应。

讨论

1. 检测性能优势：P-LAMP 在临床验证中表现出 100% 的特异性和敏感性，检测限仅略高于 qPCR。与之前使用 IS₂₄₀₄ LAMP 检测溃疡分枝杆菌的研究相比，性能更优。尽管 P-LAMP 是定性检测，但 Tp 值与 qPCR 的 Ct 值显著相关，有望指示样本中的细菌载量。
2. 检测时间和设备：P-LAMP 运行时间为 32 分钟 25 秒，比 qPCR（61 分钟 13 秒）短。Mic PCR 平台适合现场使用，但设备耗材体积小，操作时需注意避免污染，建议样本检测做重复实验。
3. 特异性和潜在发展方向：P-LAMP 通过荧光探针杂交克服了传统 LAMP 检测易产生假阳性的问题，且未牺牲敏感性。此外，基于探针的 LAMP 技术具有单管多重检测的潜力，可添加人类 DNA 靶点或内部阳性对照，增强检测的临床稳健性。
4. 未来应用前景：将现有冻干技术应用于 IS₂₄₀₄ P-LAMP 检测，可简化反应；结合微流控等技术，有望降低成本。随着技术发展，改进后的 IS₂₄₀₄ P-LAMP 有望成为指导布氏溃疡消除工作的合适诊断测试。