探秘芽孢杆菌：TerC 家族蛋白 MeeY 助力表面活性素输出的关键作用

本文聚焦芽孢杆菌（Bacillus subtilis），发现 TerC 家族蛋白 MeeY 对表面活性素（surfactin）输出至关重要。MeeY 影响群体游动性，与 SwrC 相互作用，或通过金属化促进表面活性素释放，为深入理解其合成机制及工业发酵应用提供新视角。

　　

引言

TerC 家族蛋白是广泛存在且高度保守的跨膜蛋白，具有七个跨膜片段，属于 LysE 超家族，与金属转运功能相关。最初在赋予对有毒类金属碲酸盐抗性的操纵子中被发现，但在大多数不太可能接触到有毒碲酸盐的生物中也存在，暗示其功能更为广泛。例如，大肠杆菌（E. coli）的 Alx 蛋白、拟南芥（Arabidopsis）的 AtTerC 蛋白和人类的 TMEM165 蛋白，分别在钙或锰离子运输、光合复合物合成以及蛋白质糖基化等过程中发挥作用。

在芽孢杆菌（B. subtilis）中，编码了两个 TerC 蛋白 MeeF 和 MeeY，它们在锰离子（Mn²⁺）输出功能上存在重叠，还参与锰依赖的膜蛋白和分泌蛋白的成熟过程。此外，还有第三个 TerC 旁系同源物 YjbE，在孢子形成过程中表达，功能尚未明确。此前研究发现，缺乏 MeeF 和 MeeY 的双突变体（FY 突变体），蛋白质分泌显著减少，可能是由于分泌过程中蛋白质未能正确金属化，导致 SecYEG 分泌转运体堵塞。同时，该突变体在 LB 培养基上生长不良，脂磷壁酸合酶（LtaS）活性降低。

本研究使用未驯化的芽孢杆菌 NCIB3610 菌株，该菌株具有群体游动和泳动等复杂发育表型，而常用的实验室菌株B. subtilis 168 因特定基因突变无法群体游动。研究发现，NCIB3610 菌株的meeY突变体群体游动能力缺失，这与表面活性素（surfactin）产生缺陷有关，表明 MeeY 可能通过影响表面活性素释放参与这一过程。

结果

1. MeeY 蛋白对群体游动性至关重要：在未驯化的 NCIB3610 菌株中构建meeF、meeY和yjbE基因的单突变体、双突变体和三突变体，通过点接种细菌在含 0.7% 琼脂的 LB 平板上，测量群体游动半径随时间的变化。结果显示，缺失meeY的突变体，无论是单突变体还是FY双突变体，都丧失了群体游动能力；meeF单突变体的群体游动直径则有适度但可重复的减小。利用木糖诱导型启动子异位表达meeY，能够部分恢复meeY突变体的群体游动缺陷，但无法完全恢复，这可能是因为meeY正常表达受多种调控，包括 Mn²⁺感应核糖开关的调控。

为探究 MeeF 和 MeeY 对泳动能力的影响，将相关突变导入消除群体游动和滑动能力的菌株背景中。结果发现，meeY和meeF单突变体在该背景下泳动能力正常，而FY双突变体泳动能力大幅降低。考虑到FY突变体具有多效性且在 LB 培养基上生长受损，本研究主要聚焦于meeY单突变体的群体游动缺陷。2. meeY 群体游动缺陷并非由鞭毛合成减少导致：与泳动细菌相比，群体游动细胞每个细胞的鞭毛数量更多。由于FY突变体先前被证明在蛋白质分泌方面存在缺陷，因此推测meeY菌株可能存在鞭毛合成能力降低的问题。通过 SDS-PAGE 测量 3610 野生型（WT）和突变体衍生物中鞭毛蛋白（Hag 蛋白）的水平，发现meeF和meeY单突变体中 Hag 蛋白水平有适度下降（小于 2 倍），FY突变体中下降更为严重。

为进一步确定突变体中鞭毛蛋白水平降低的原因，是每个细胞的鞭毛数量减少还是鞭毛丝平均长度改变，利用三维结构光照明显微镜（3D-SIM）对单个细胞中的基体数量进行量化。结果显示，3610 菌株与meeF（群体游动能力正常）和meeY（群体游动能力缺陷）衍生物之间，每个细胞的基体数量没有显著差异。不过，缺乏一个或多个 TerC 旁系同源物的细胞，相比 WT 细胞长度有所增加，单位细胞长度的基体数量略有减少，但这种减少与群体游动能力并不相关。3. meeY 群体游动缺陷可通过细胞外互补恢复：部分导致群体游动缺陷的突变可通过细胞外互补恢复，如影响表面活性素合成的突变。将群体游动缺陷的meeY或FY突变体与群体游动缺陷的 3610 hag基因敲除突变体共接种，群体游动能力得以恢复。这是因为hag突变体虽无鞭毛但能产生表面活性素，表面活性素从其细胞扩散，可支持meeY和FY突变体的群体游动。然而，meeY或FY突变体与 3610 srfAA衍生物混合时，未观察到细胞外互补现象，因为srfAA突变体无法产生表面活性素。此外，不能产生表面活性素的 CU1065 菌株也无法互补meeY突变体的群体游动缺陷，而修复 CU1065 菌株中sfp⁰突变使其恢复表面活性素合成能力后，该菌株（CU1065 sfp⁺）能够互补meeY和FY菌株的群体游动缺陷。

通过过滤除菌收集细胞上清液进行实验，发现来自能产生表面活性素菌株（3610、3610 meeF、3610 hag和 CU1065 sfp⁺）的上清液可恢复meeY细胞的群体游动能力，而不能产生表面活性素菌株（3610 srfAA、CU1065 sfp⁰）的上清液则无此作用。添加纯化的表面活性素也能恢复meeY菌株的群体游动能力，这些结果表明meeY突变体无法群体游动是由于表面活性素产生缺失。

讨论

表面活性素具有商业潜力，在化妆品、个人护理和制药等领域有应用，但目前微生物产生的脂肽类生物表面活性剂在市场份额中占比小于 5%。早期研究发现金属离子，尤其是锰离子，对表面活性素的最佳生产至关重要，但锰离子增强表面活性素产量的机制一直未明确。本研究表明，TerC 家族的锰离子输出蛋白 MeeY 对表面活性素的高效生产是必需的。

TerC 家族蛋白在生命的三个领域都有发现，功能多样。在细菌中，其同源物最初与质粒上的碲酸盐抗性操纵子相关。大肠杆菌的 Alx 蛋白和芽孢杆菌的 MeeY 蛋白都受yybP/ykoY家族核糖开关调控，在细胞内锰离子浓度升高时表达上调。MeeY 及其旁系同源物 MeeF 在芽孢杆菌中参与锰离子输出，支持胞外酶的金属化过程。

本研究发现 MeeY 对芽孢杆菌 3610 的群体游动性是必需的，meeY突变体因表面活性素输出缺失而群体游动缺陷。表面活性素由非核糖体蛋白合成酶（NRPS）复合物合成，该复合物由srfAA - AB - AC - AD操纵子编码，合成后由 SwrC（YerP）等蛋白转运出细胞。研究提出一种模型，即 MeeY 可能在表面活性素排出细胞时将锰离子加载到其中，引发构象变化，从而促进脂肽从细胞中有效释放。释放到细胞外的表面活性素是否保留结合的阳离子，取决于培养基中的阳离子浓度。

目前表面活性素的输出细节尚未完全明确。SwrC 是抗性 - 结节 - 细胞分裂（RND）家族的质子偶联外排蛋白，在群体游动过程中与表面活性素输出密切相关。化学抑制剂抑制质子梯度会抑制表面活性素输出，过表达 SwrC 则显著增加表面活性素产量。此外，SwrC 与 MeeY - FLAG 蛋白的免疫共沉淀实验表明二者存在物理相互作用，且表面活性素合成酶蛋白也在免疫共沉淀实验中被检测到，提示合成酶可能与分泌复合物相互作用。但 SwrC 也能与 MeeF - FLAG 蛋白免疫共沉淀，尽管 MeeF 单独不能支持表面活性素生产，一种可能的解释是 TerC 蛋白可形成同源或异源寡聚体，MeeY 和 MeeF 的复合物可能支持表面活性素输出。

虽然已有证据表明 MeeY 和 MeeF 与锰离子输出有关，但其他 TerC 相关蛋白可运输钙离子（Ca²⁺）。目前 MeeY 促进表面活性素生产所需输出的金属离子性质尚不清楚，不过鉴于 MeeY 和 MeeF 输出锰离子的证据，推测锰离子是相关离子。此前关于二价阳离子对表面活性素结构和活性影响的研究多集中于钙离子，对锰离子的研究较少。此外，表面活性素可能结合其他二价阳离子，例如用纯化的表面活性素处理芽孢杆菌会诱导与锌离子消耗相关的基因表达。进一步研究 TerC 家族金属输出蛋白的金属选择性，以及对天然分泌的表面活性素的离子配位进行表征，将有助于解决这一问题。

材料和方法

1. 细菌菌株和生长条件：本研究使用的所有菌株列于相关表格中。168 背景的突变体菌株从芽孢杆菌遗传保藏中心（BGSC）获得，为带有红霉素或卡那霉素标记的基因敲除突变体。通过质粒 pDR244 转化去除标记基因，在 CU1065（168 衍生物）中构建无标记的框内突变体。利用同源重组构建 CU1065 的sfp⁺衍生物。NCIB 3610 背景的突变体通过 SPP1 介导的广义噬菌体转导构建，基因缺失通过 PCR 分析确认。
2. 生长条件：细菌在液体或固体溶原肉汤（LB）培养基中，37℃培养。LB 培养基每升含有 10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物和 5g NaCl。用于筛选芽孢杆菌菌株的抗生素包括：壮观霉素 100μg/mL、大环内酯 - 林可酰胺 - 链阳菌素 B（MLS = 1μg/mL 红霉素 + 25μg/mL 林可霉素）、卡那霉素 15μg/mL。用于转化的 MC 培养基包含多种成分。
3. 群体游动和泳动细胞扩展实验：群体游动能力检测按照之前描述的方法进行。培养物在 LB 肉汤中 37℃好氧培养至 OD₆₀₀约 0.5，处理后接种在不同琼脂浓度的 LB 平板上，测量群体游动半径。泳动能力检测则是将单菌落穿刺接种在含 0.3% 琼脂的 LB 平板中心，37℃培养 12h 后拍照。
4. 通过 SDS - PAGE 凝胶检测鞭毛蛋白：细胞在液体 LB 培养基中 37℃培养至 OD₆₀₀约 0.5，处理后进行 SDS - PAGE 电泳，染色、脱色后用凝胶成像系统拍照，利用 ImageJ 软件分析条带强度。
5. 通过显微镜检测基体和细胞长度：将 MeeF 和 MeeY 突变转化到带有 GFP 标记的菌株中，利用超分辨率荧光显微镜观察，使用特定的激光和发射滤光片，通过相关软件进行图像采集、处理和分析。
6. 细胞外互补实验：收集细胞培养物的上清液，离心、过滤后与新鲜 LB 琼脂混合固化，接种处理后的细胞，37℃过夜培养后拍照。化学互补实验则是将细菌培养至对数中期，处理后接种在含或不含纯化表面活性素的 LB 平板上，37℃培养并拍照。