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登革病毒（DENV）有 4 种血清型，每年感染数亿人。现有减毒活疫苗面临复制不均衡问题。本文研究的稳定 DENV2 包膜（E）蛋白同源二聚体亚单位疫苗，能刺激产生针对 E 蛋白多个区域的中和抗体（NAbs），为 DENV 疫苗研发提供新方向，值得关注。
登革病毒疫苗研究背景
登革病毒（DENV）有 4 种血清型，是通过蚊子传播的黄病毒，每年在热带和亚热带地区致使数亿人感染。2024 年 1 月至 6 月，仅美洲地区就有近 1000 万疑似登革热病例。感染登革病毒后，临床症状多样，从无症状到登革热、登革出血热以及休克综合征等。
接种疫苗是预防黄病毒感染的有效手段，针对其他致命黄病毒，如黄热病病毒和日本脑炎病毒，都已研发出有效的疫苗。但登革病毒疫苗必须是四价的，因为对单一血清型产生的免疫反应，可能会导致异源血清型抗体依赖性增强复制，进而引发更严重的临床疾病。
目前最先进的登革病毒疫苗是基于四价减毒活病毒配方。其中，Dengvaxia 和 Qdenga 这两款领先的候选疫苗，虽已在部分国家的特定人群中获批使用，但都存在减毒疫苗病毒复制不均衡的问题，常导致仅对一两种血清型产生有效免疫，而对其他血清型免疫效果不佳。在临床试验中，接种 Dengvaxia 的无登革病毒免疫儿童，比未接种儿童更易住院，该疫苗目前仅批准用于已感染过登革病毒的儿童；Qdenga 在血清阴性儿童中，对 DENV1 和 DENV2 有效，但对 DENV3 无效，且由于 DENV4 病例数量不足，无法评估其对该血清型的有效性。
基于病毒包膜（E）蛋白的登革病毒亚单位疫苗，在临床前和早期临床研究中表现不佳。原因可能在于生理条件下，可溶性 E 蛋白大多以单体形式存在，无法展示病毒表面依赖二聚体的关键抗体表位，而人类中和抗体（NAbs）正是识别这些表位来发挥作用的。
研究人员此前利用结构引导的计算方法和实验，制备出了稳定的 DENV E 同源二聚体，其能展示被人类 NAbs 识别的四级结构表位。本研究旨在比较 DENV2 野生型（WT）和二聚体稳定的重组 E 蛋白（rE）作为疫苗抗原时，在小鼠体内诱导产生的 NAbs 的特异性和抗原表位靶点。
稳定 DENV2 重组 E 同源二聚体的免疫原性：两剂研究
研究人员选用了先前描述过的重组 DENV2 E 蛋白进行实验，其中稳定的 E 同源二聚体（SD*FL）含有多个能稳定二聚体结构的突变，如在 E 结构域（ED）II 的二聚体界面有 A259W、T262R 突变，在 EDI 和 EDIII 之间的铰链区有 F279W、T280P 突变，在融合环有 G106D 突变。
实验选取 Balb/c 小鼠，分为多组，分别用 WT rE 和 SDFL 在有无佐剂（Alum）的情况下进行初次免疫和加强免疫（第 3 周）。在接种 12 周后检测发现，与接种 WT rE 的小鼠相比，接种 SDFL 的小鼠体内产生了更多与 DENV2 结合的抗体。同时，SDFL 免疫的小鼠对 E 单体和二聚体抗原的抗体水平都更高，且其抗体反应更倾向于结合二聚体而非单体。此外，SDFL rE 抗原刺激产生的中和抗体水平也高于 WT rE。这些结果表明，稳定的二聚体抗原在刺激产生结合抗体（更倾向于结合 E 同源二聚体）和中和抗体方面，比 WT E 抗原表现更优。
稳定 DENV2 重组 E 同源二聚体的免疫原性：两剂与三剂研究比较
为了进一步探究抗原结构对免疫原性的影响，研究人员在不使用佐剂的情况下，比较了两剂和三剂接种方案的免疫原性。目的是获得中高滴度的血清，用于分析 WT 和 SD*FL rE 抗原刺激产生的 NAbs。
实验结果显示，两剂接种的结果再次证实了之前的发现，即 SDFL 刺激产生的结合抗体更倾向于二聚体，且中和抗体水平高于 WT rE。而三剂接种的小鼠，其结合抗体和中和抗体水平均高于两剂接种的小鼠。在三剂接种方案中，SDFL rE 依然刺激产生了更倾向于结合二聚体的抗体。不过，在第 12 周时，WT 和 SDFL rE 在三剂研究中的中和抗体反应相似。这表明在两剂接种方案中，SDFL 刺激产生的较高水平中和抗体可持续到第 12 周，而第三剂疫苗对 WT rE 较低的免疫反应有明显的增强作用，使得两种抗原在第 12 周时诱导产生的中和抗体水平相当。
绘制 WT 和 SD*FL rE 疫苗刺激产生的 DENV 中和抗体图谱
研究人员利用三剂研究中第 12 周的高滴度血清，进一步分析 WT 和 SD*FL 疫苗抗原刺激产生的 NAbs。在对四种 DENV 血清型进行中和实验时，发现两种疫苗构建体诱导产生的血清都能强烈中和 DENV2，但对其他血清型无明显中和作用，这表明两种疫苗诱导产生的主要是 DENV2 型特异性 NAbs。
为了更精确地绘制疫苗血清的中和抗体图谱，研究人员使用了一组 DENV4/2 E 结构域移植嵌合病毒。这些嵌合病毒以 DENV4 为骨架，分别移植了 DENV2 的不同结构域（EDI、EDII 或 EDIII）。实验结果显示，WT 和 SDFL 抗原诱导产生的抗体都能中和 DENV4/2 EDIII 嵌合病毒，这表明存在针对 DENV2 EDIII 的中和抗体，以及跨越 EDII/EDIII 的抗体，如 2D22。但 SDFL rE 还能诱导产生中和 DENV4/2 EDI 和 EDII 嵌合病毒的抗体，而 WT rE 刺激产生的针对 EDI 的中和抗体水平较低，且未检测到针对 EDII 的中和抗体。这说明 WT rE 主要诱导产生针对 EDIII 的中和抗体，而 SD*FL rE 能刺激产生针对所有三个结构域的更广泛的中和抗体反应。
表征 WT 和稳定二聚体免疫小鼠产生的 EDIII 抗体
中和 DENV2 的抗体可识别简单的单一结构域内表位，或跨越不同 E 分子上两个不同结构域的复杂表位。例如，DENV2 型特异性中和小鼠单克隆抗体（mAb）3H5 结合 EDIII 外侧脊上的简单表位；而 DENV2 型特异性中和人单克隆抗体 2D22 识别的表位以 EDIII 为中心，延伸到形成同源二聚体的第二个 E 原聚体的 EDII 保守氨基酸上，这种跨二聚体相互作用对 2D22 结合 DENV2 至关重要，也导致 2D22 与可溶性 EDIII 结合较差。
研究人员通过重组 DENV2 EDIII 进行抗体耗竭实验，来评估简单 EDIII 结合抗体对疫苗接种后中和作用的贡献。实验中，血清与包被有 DENV2 EDIII 的珠子孵育，通过酶联免疫吸附测定（ELISA）确认 EDIII 结合抗体被有效去除。结果显示，去除简单 EDIII 结合抗体后，WT E 免疫血清对 DENV2 的中和作用降至检测限以下；而在 SDFL rE 免疫的动物中，虽然去除 EDIII 结合抗体也降低了中和抗体水平，但仍有部分中和抗体（约占总反应的 30% - 40%）对 EDIII 耗竭有抗性。结合 DENV4/2 嵌合 E 病毒实验结果，表明 SDFL 能刺激产生针对 E 蛋白所有三个结构域的中和抗体。
研究讨论
过去，基于 E 蛋白胞外结构域的 DENV 蛋白亚单位疫苗，在非人灵长类动物（NHPs）和人类临床试验中表现不佳。疫苗刺激产生的中和抗体水平在接种后的前 6 - 12 个月急剧下降，接种疫苗的 NHPs 在感染 DENV 后，部分得到保护，部分却出现突破性病毒血症。这可能是因为重组 E 蛋白在 37℃时大多以单体形式存在，与病毒表面的二聚体结构不同。
本研究对比了 37℃时呈单体（WT）和同源二聚体（SD*FL）形式的可溶性 E 蛋白抗原诱导产生的 DENV2 NAbs 特性。结果表明，稳定的同源二聚体能刺激产生针对病毒包膜多个区域的 DENV2 NAbs，而 WT E 抗原主要刺激产生针对简单 EDIII 表位的 NAbs。改变 DENV2 E 蛋白的寡聚状态，使其更接近感染性病毒表面的抗原结构，有望诱导产生针对 E 蛋白所有三个结构域的抗体。
目前领先的 DENV 疫苗候选方案基于四价减毒活黄病毒平台，开发过程面临诸多挑战，如疫苗病毒复制差异导致免疫失衡，偏向单一血清型或血清型内的单一基因型，在临床试验中还可能引发疫苗增强的野生型 DENV 感染等不良后果。相比之下，模拟病毒包膜结构的蛋白亚单位疫苗是一种有前景的替代策略，它不依赖于每种疫苗成分的平衡复制。
研究人员常用 DENV 中和试验来评估疫苗反应和作为保护的相关指标，但在临床试验中，仅存在针对每种血清型的中和抗体并不能可靠预测保护效果。实验室研究用的 DENV 大多是部分成熟的病毒粒子，对一些低亲和力抗体高度敏感，这些抗体对人体中循环的成熟 DENV 可能没有保护作用。本研究使用在过表达 DENV 加工和成熟所需蛋白酶的细胞系中产生的完全成熟 DENV2 病毒株，控制病毒成熟状态，更准确地评估疫苗对成熟 DENV2 的免疫反应。在此条件下，两剂稳定的 E 同源二聚体刺激产生的成熟 DENV2 NAbs 水平高于 WT E 蛋白。不过，本研究仅监测了第三剂疫苗接种后 4 周内的情况，未探讨中和抗体的持久性。
针对 E 蛋白不同区域的中和抗体能在病毒进入细胞的不同阶段（附着、内化、膜融合）发挥阻断作用，降低疫苗逃逸的可能性。DENV E 蛋白的不同结构域在病毒生命周期中发挥不同作用，EDIII 参与病毒与宿主细胞受体的初始附着，EDII 对 E 蛋白二聚化至关重要，且含有病毒进入细胞时膜融合所需的融合环。自然感染 DENV 的人会产生针对 E 蛋白不同结构域多个表位的中和抗体，这些抗体对同一血清型的不同基因型都有广泛的中和作用。而减毒活 DENV 疫苗刺激产生的中和抗体反应较为集中，针对同一血清型内不同基因型的中和作用范围较窄，存在因疫苗匹配不当的基因型感染而导致突破感染的风险。本研究中，WT E 疫苗主要刺激产生针对 EDIII 的中和抗体，而该区域表位在同一血清型的不同 DENV 基因型间存在差异，可能导致中和效力不同，甚至使病毒逃逸；SDFL 疫苗则能诱导产生针对所有三个结构域表位的中和抗体反应，理论上比单一靶点的反应具有更广泛的中和作用，但还需进一步研究评估 WT 和 SDFL rE 疫苗对匹配和变异 DENV2 基因型的有效性。
总之，本研究支持进一步开发和评估基于 E 二聚体的亚单位疫苗。研究发现，用于稳定 DENV2 同源二聚体的突变，经微小的病毒特异性修饰后，也适用于其他三种血清型和寨卡病毒。目前，针对 DENV1、DENV3 和 DENV4 的亚单位疫苗研究正在进行中，因为登革病毒疫苗必须是四价的，以降低抗体依赖增强（ADE）的风险。此外，研究人员还在评估不同的疫苗递送平台（如纳米颗粒、脂质体、核酸）和佐剂，以提高疫苗的免疫原性和免疫反应的持久性。
