疫苗免疫压力下冠状病毒 PEDV 免疫逃逸的分子特征研究：揭示关键位点，助力防控新突破

本文聚焦猪流行性腹泻病毒（PEDV），通过制备多克隆抗体（pAb）及体外传代实验，鉴定出 S 蛋白第 1273 位氨基酸易突变，突变后的 rA1273P 菌株能逃避抗体中和，且毒力与野生型相当。该研究为解释冠状病毒免疫逃逸提供新视角，对防控有重要意义。

　　### 引言
冠状病毒可引发人类和动物的多种疾病，对健康和经济造成威胁。其 S 蛋白在病毒感染中起关键作用，且易发生突变和重组，影响病毒特性。猪流行性腹泻病毒（PEDV）属于 α 冠状病毒属，自 20 世纪 70 年代被发现后，给全球养猪业带来巨大损失。尽管使用了疫苗，但 PEDV 的流行和感染率仍居高不下。目前已知 PEDV 的 S 蛋白有多个中和表位区域，S 基因序列突变是其毒力变化的主要原因，但关键氨基酸突变尚不清楚。本研究旨在筛选逃避中和抗体的突变菌株，确定关键氨基酸残基，评估其对病毒特性的影响，并通过动物实验验证其在 PEDV 致病性和抗体中和中的作用。

材料和方法

1. 病毒和细胞：使用 PEDV 菌株 AH2012/12，在含有特定成分的培养基中培养，Vero 细胞在含 10% 胎牛血清（FBS）的 DMEM 培养基中培养。
2. 制备抗 PEDV 多克隆抗体（pAb）：用甲醛溶液灭活纯化的 PEDV AH2012/12 颗粒，与佐剂乳化后免疫仔猪，收集血清并处理保存。
3. 通过连续传代获得 pAb 逃逸病毒：将 PEDV AH2012/12 与 pAb 混合，接种到 Vero 细胞，在 pAb 存在下培养，观察细胞病变效应（CPE），定期对 S 基因测序，直至两组同时出现 CPE 时终止传代。
4. 构建重组 PEDV：利用 CRISPR/Cas9 技术构建重组 PEDV 菌株，通过重叠 PCR、体外转录等步骤制备靶向 S 基因的 sgRNAs，对重组 BAC 质粒进行切割和重组，经测序验证突变位点。
5. 病毒空斑试验：对 PEDV 菌株进行 10 倍系列稀释，接种到 Vero 细胞，培养后固定染色观察空斑。
6. 病毒生长动力学分析：用相应 PEDV 以 0.1 MOI 接种 Vero 细胞，在不同时间点收集细胞上清液，用 50% 组织培养感染剂量（TCID₅₀）法测定病毒滴度。
7. 免疫荧光试验（IFA）：用相应 PEDV 感染 Vero 细胞，固定、封闭后依次与小鼠抗 PEDV N 单克隆抗体、山羊抗小鼠 IgG 抗体（偶联 FITC）和 DAPI 孵育，在荧光显微镜下观察。
8. 病毒中和试验：将 pAb 灭活、稀释后与 PEDV 混合，接种到 Vero 细胞，观察细胞内 CPE，判断 pAb 对 PEDV 的中和能力。
9. RNA 提取和实时定量 PCR（RT-qPCR）：从感染 PEDV 的 Vero 细胞、肠道拭子或组织样本中提取 RNA，反转录为 cDNA 后进行 RT-qPCR，检测 PEDV N mRNA 表达水平或病毒 RNA 含量。
10. pAb 抑制 PEDV 吸附试验：pAb 与 PEDV 孵育后，与预冷的 Vero 细胞孵育，通过提取 RNA 和 IFA 观察 pAb 对病毒吸附的影响。
11. 免疫印迹分析：用 PEDV AH2012 感染 Vero 细胞，裂解细胞后进行 SDS-PAGE 电泳，转膜、封闭，与 pAb 和 HRP 偶联的二抗孵育，用化学发光底物检测。
12. 评估重组 PEDV 的致病性：将 5 日龄仔猪分为三组，分别用指定病毒口服攻毒，观察临床症状，采集直肠拭子检测病毒 shedding，对仔猪进行安乐死后，对小肠进行染色分析。
13. 用 AH2012/12 疫苗免疫仔猪后攻毒：将 5 日龄仔猪分组，免疫组注射灭活 PEDV 疫苗，对照组注射 PBS，加强免疫后进行病毒攻毒试验，观察症状、检测病毒 shedding 和组织病理变化。
14. PEDV S 蛋白建模：使用 AlphaFold3 分析亲本菌株和 rA1273P 菌株的 S 蛋白结构，用 PyMOL 软件可视化和比较。
15. 统计分析：数据以平均值 ± 标准差（SD）表示，使用 GraphPad Prism 软件 8 进行统计分析。

结果

1. PEDV S 在抗体压力下发生多点突变：制备的 pAb 能特异性结合 S 蛋白和 PEDV 感染细胞，有效中和病毒感染，抑制病毒吸附。在抗体压力下连续传代 PEDV，发现中和抗体效价逐渐降低，病毒 S 基因在不同代次出现多个氨基酸突变，包括第 976 位的 Y 突变为 H、第 1005 位的 S 突变为 A、第 1273 位的 A 突变为 P。
2. 重组 PEDV 菌株的构建和特性：成功构建了 rY976H、rS1005A 和 rA1273P 三种重组菌株，其能感染细胞并诱导与野生型相似的细胞病变效应，生长动力学和空斑形态与野生型无差异。rA1273P 菌株逃避血清抗体中和的能力显著高于其他菌株。
3. 重组病毒的毒力评估：用重组病毒 rA1273P 和野生型病毒感染 5 日龄仔猪，结果显示二者引起的腹泻严重程度、病毒 shedding 模式、临床症状、组织病理变化和病毒载量等方面均无显著差异，表明 rA1273P 菌株与野生型菌株致病性相当。
4. 重组病毒在体外逃避中和抗体：用灭活 AH2012/12 PEDV 免疫仔猪后攻毒，免疫组血清中 IgG 抗体水平显著升高，但对 rA1273P 菌株的保护效果不佳，而对野生型 rAH2012 病毒有较强的保护能力。
5. 重组病毒在体内逃避中和抗体：监测仔猪攻毒后的临床症状发现，免疫组感染 rA1273P 菌株后腹泻更严重，病毒载量更高，小肠绒毛损伤更明显。对 NCBI 数据库中 PEDV 菌株的 S 蛋白氨基酸序列分析发现，疫苗株第 1273 位氨基酸为 A，部分临床菌株存在变异。
6. S 蛋白 A1273P 突变不改变整体结构：PEDV 的 S 糖蛋白由 S1 和 S2 亚基组成，第 1273 位氨基酸位于 S2 亚基的 HR2 区域。AlphaFold3 分析显示，A1273P 突变位于 HR2 侧链，不破坏 HR1HR2 蛋白束和 S 蛋白三聚体结构，可能通过改变蛋白构象使病毒逃避 pAb 中和。

讨论

本研究表明，在 pAb 免疫压力下，PEDV S 蛋白发生点突变，A1273P 突变使病毒逃避 pAb 中和，且不影响病毒毒力，能在体内外逃避抗体压力并成功感染仔猪。以往研究发现体外连续传代可降低病毒毒力，但本研究中 40 代传代病毒未出现致病性降低，可能与使用单突变位点的拯救病毒、传代次数有限及仅对 S 基因测序有关。

传统观点认为 S1 结构域介导病毒进入和诱导中和抗体，S2 结构域负责膜融合，但研究发现 S2 亚基也能诱导产生中和单克隆抗体。本研究鉴定出 S2 蛋白 HR2 区域的 A1273P 突变是新的中和抗体关键结合位点，该突变可能通过改变抗原表位空间结构使病毒逃避中和。虽然本研究使用多克隆抗体压力揭示了病毒免疫逃逸机制，但还需用不同单克隆抗体进一步筛选病毒易突变的关键位点。

此外，监测和预测 PEDV 的进化方向对控制其传播至关重要。疫苗的使用加速了 PEDV 的进化，研究免疫压力下的病毒进化有助于预测病毒进化方向，为防控变异病毒感染和设计疫苗提供技术支持。本研究通过人工诱变获得逃避中和抗体的 PEDV 突变菌株，发现新的中和表位，为理解冠状病毒免疫逃逸提供了更深入的认识，也为防控冠状病毒感染提供了新的干预策略。