解析 CBCVd 感染啤酒花植株全基因组 DNA 甲基化，揭示类病毒致病新机制

这篇研究对感染柑橘裂皮类病毒（CBCVd）的啤酒花植株进行了表观基因组分析，发现部分参与病原体相互作用通路的基因低甲基化，而与 RNA 转录等相关基因高甲基化，为 CBCVd 致病机制中 DNA 甲基化的作用提供了新证据。

　　### 引言
类病毒是一类极小的单链 RNA 分子，能引发植物病害，其复制依赖宿主植物的酶。柑橘裂皮类病毒（Cocadviroid rimocitri，曾用名 Citrus bark cracking viroid，CBCVd）对啤酒花（Humulus lupulus）的生产构成严重威胁。

植物在应对生物胁迫时，会发生复杂的分子变化，其中 DNA 甲基化等表观遗传修饰在调控基因表达方面起着关键作用。已有研究表明，类病毒感染会导致植物转录组改变，且类病毒可通过与宿主 RNA 指导的 DNA 甲基化途径（RNA-directed DNA methylation pathway，RdDM）相互作用，影响宿主 DNA 甲基化模式。然而，目前对类病毒诱导宿主 DNA 甲基化变化的全基因组研究较少。本研究旨在探索 CBCVd 感染啤酒花植株后全基因组 DNA 甲基化的改变，并建立这些表观遗传变化与转录组修饰之间的关联，以揭示植物应对类病毒胁迫时基因活性的重编程机制。

材料与方法

1. 植物培养：选取无病毒和类病毒的啤酒花 “Celeia” 克隆植株，用基因枪接种 360 ng 的二聚体 CBCVd 构建体（GenBank KM211546），设置未感染的对照植株。接种后，植株先在高湿度环境下培养，1 周后移栽至 4 L 花盆，并转移到隔离的田间地块。在植株生长至 BBCH 38 阶段时，采集完全展开的叶片，迅速冷冻保存。
2. DNA 提取：采用十六烷基三甲基溴化铵（cetyltrimethylammonium bromide，CTAB）法从啤酒花叶片粉末中提取 DNA。提取过程包括多次离心、沉淀、洗涤等步骤，最后用 RNase A 去除 RNA，通过分光光度计和琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 质量和完整性。
3. 亚硫酸氢盐测序：将 DNA 样品送至 Novogene Europe 进行全基因组亚硫酸氢盐测序（whole-genome bisulfite sequencing，WGBS）。DNA 样品经质量控制后，进行片段化、亚硫酸氢盐处理、接头连接、双链 DNA 合成、文库制备和 PCR 扩增。
4. 转录组数据：整合前期研究的转录组数据（BioProject PRJNA528793），对原始读数进行修剪和比对，使用 DESeq2 进行差异基因表达分析。
5. 差异甲基化区域（DMRs）的鉴定：将 WGBS 数据导入 CLC Genomics Workbench，进行数据处理和分析。设置一系列参数，包括比对参考基因组、去重、甲基化水平检测和统计分析等，以鉴定 DMRs，并进一步筛选出高甲基化和低甲基化的蛋白编码基因。
6. 高甲基化和低甲基化蛋白编码基因分析：通过 BLASTx 比对数据库，对差异甲基化的编码序列（DMG）进行功能注释。利用 Blast2GO 和 KEGG 自动注释服务器（KAAS）进行基因本体（Gene Ontology，GO）分析和京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析，并进行富集分析。
7. 总 RNA 提取和差异基因表达分析：使用 Monarch Total RNA Miniprep Kit 提取总 RNA，进行逆转录合成 cDNA。设计 qPCR 引物，利用 QuantStudio 5 实时荧光定量 PCR 系统检测基因表达水平，以 DRH1 为内参基因，采用 Pfaffl 法计算相对表达量，通过 Duncan 多重范围检验评估统计显著性。

结果

1. 测序数据质量和比对结果：WGBS 共产生 559.6 Gb 数据，约为啤酒花基因组估计大小 3 Gb 的 30 倍覆盖度。感染和未感染植株的测序数据质量良好，有效比对率较高，原始读数提交至 SRA（BioProject ID PRJNA980399）。
2. DNA 甲基化水平分析：总体上，CBCVd 感染对啤酒花植株基因组的整体 DNA 甲基化水平无显著影响，但在特定的甲基化背景和基因功能区域存在差异。在基因侧翼区域，CHH 背景下的 DNA 甲基化水平在感染植株中显著升高；在基因体功能区域，CDS 中的 CpG 和 CHG 背景、3′-UTR 中的 CHG 和 CHH 背景的 DNA 甲基化水平在感染植株中较高。
3. DMRs 的鉴定和分析：共鉴定出 2,196,528 个具有统计学意义（P 值≤0.05）的 100 bp DMRs，经 FDR 校正（P 值≤0.05）后，得到 1,967,901 个 DMRs。进一步筛选出绝对甲基化率差异≥15% 的 DMRs，最终确定 9,661 个高甲基化 DMRs 和 11,013 个低甲基化 DMRs。这些 DMRs 在不同甲基化背景和基因组区域的分布存在差异，大部分 DMRs 位于基因间区域。
4. 功能注释和富集分析：对高甲基化和低甲基化的蛋白编码基因进行 GO 和 KEGG 分析。高甲基化 DMGs 与微管运动、驱动蛋白复合物、ATP 结合等过程相关；低甲基化 DMGs 与维持分生组织特性、叶绿体膜、纤维素合成酶活性等过程相关。KEGG 分析显示，高甲基化 DMGs 涉及吞噬体相关过程、代谢途径等；低甲基化 DMGs 涉及二萜生物合成、植物 - 病原体相互作用等多种途径。
5. 转录组和甲基化组数据整合分析：结合转录组数据，鉴定出与 DNA 甲基化状态相关的差异表达基因。对这些基因进行 GO 和 KEGG 分析，发现与植物 - 病原体相互作用、MAPK 信号通路、植物激素信号转导等过程显著富集。
6. 基因表达验证：通过 RT-qPCR 对 13 个基因进行表达验证，结果显示 RT-qPCR 数据与 RNA-seq 数据的 Pearson 相关系数 R²为 0.71，表明 RNA-seq 数据可靠。

讨论

本研究通过对 CBCVd 感染啤酒花植株的全基因组 DNA 甲基化分析，深入探讨了类病毒感染与宿主 DNA 甲基化之间的关系。转录组变化通常先于表观遗传改变，DNA 去甲基化在植物免疫反应中对防御基因的转录激活起重要作用，而高甲基化可能导致基因转录沉默。

在 CBCVd 感染的啤酒花植株中，观察到 DNA 甲基化模式的微妙变化，如基因侧翼区域 CHH 背景的高甲基化、蛋白编码序列和 3′-UTR 特定背景的高甲基化等，这些变化可能与 RdDM 途径的干扰有关。同时，鉴定出的高甲基化和低甲基化 DMGs 参与多种生物学过程和代谢途径，影响植物的生长发育、防御反应和代谢平衡。

例如，高甲基化的 DMGs 影响植物液泡功能、代谢途径和 RNA 聚合酶活性；低甲基化的 DMGs 与 DNA 复制、RNA 控制、植物防御反应等相关。此外，还发现部分与植物防御相关的基因，如 MAPK5、LRR 受体样丝氨酸 / 苏氨酸蛋白激酶等存在高甲基化现象，其与植物防御机制的关系尚待进一步研究。而低甲基化且上调的基因则与植物 - 病原体相互作用、MAPK 途径和植物激素信号转导密切相关。

综上所述，本研究揭示了 CBCVd 感染啤酒花植株后 DNA 甲基化的变化规律，为深入理解类病毒致病机制和植物防御反应提供了重要依据，但仍有许多问题有待进一步研究，如 DNA 甲基化与其他表观遗传修饰的协同作用、这些变化在不同类病毒感染和植物物种中的普遍性等。