噬菌体长期保存方法的比较评估：形态多样性对稳定性的影响及优化策略

本研究系统评估了四种形态各异的噬菌体（T4、T7、PhiX174、MS2）在30种存储条件下的长期稳定性，首次揭示LB培养基（Luria-Bertani）在-80°C速冻保存中优于传统SM缓冲液（Saline-Magnesium）的显著优势。通过2年追踪发现，尾部长度的形态特征（如Myovirus T4）与冷冻敏感性直接相关，而甘油（Glycerol）作为冷冻保护剂可能损害特定噬菌体活性。该研究为建立标准化噬菌体库（Phage Bank）提供了关键实验依据，对推动噬菌体疗法（Phage Therapy）临床应用具有重要指导价值。

　　

ABSTRACT
噬菌体疗法因抗生素耐药性危机重新获得关注，但缺乏标准化长期保存方法。研究选取四种代表性噬菌体（T4 Myovirus、T7 Podovirus、PhiX174 Microvirus、MS2 Levivirus），系统评估温度（4°C/-20°C/-80°C）、缓冲液（LB/SM/SMG/Phage Buffer）、初始浓度（10⁸/10⁹ PFU/mL）和冷冻保护剂（甘油/明胶）的影响。通过24个月9个时间点的噬斑测定（Plaque Assay）和qPCR监测，发现LB培养基在-80°C速冻条件下表现最优，而传统SM缓冲液导致T4和MS2显著失活。

INTRODUCTION
噬菌体在医疗（FDA已批准食品应用）、农业等领域的应用激增，但形态多样性（从26nm无尾PhiX174到168kb长尾T4）导致保存效果差异。既往研究多关注单一条件，本研究首次全面分析多因素交互作用，采用qPCR同步监测基因组稳定性。

MATERIALS AND METHODS
实验选用ATCC/DSMZ标准菌株和噬菌体，通过双层噬斑法测定效价。缓冲液置换采用35,000×g超速离心，测试溶液包括含0.01%明胶（SMG）的SM缓冲液。液氮速冻（LN₂）10分钟后-80°C保存，冻干样品添加0.5M蔗糖保护。qPCR引物针对各噬菌体特征基因（如T4的163bp片段），通过熔解曲线验证特异性。

RESULTS
关键发现：

1. 形态影响：长尾T4在冷冻中损失达3.9 log PFU/mL，而无尾PhiX174仅降0.5 log
2. 缓冲液比较：LB组存活率比SM高2-3个数量级，SMG可提升T4稳定性3 log
3. 温度悖论：T4在4°C稳定而在-20°C快速失活，PhiX174则相反
4. 甘油毒性：20%甘油使T4在LB中效价下降3.7 log，但能稳定MS2 0.79 log
5. 冻干局限：冻干T4立即损失1 log，24个月后累计下降2.9 log

DISCUSSION
研究颠覆了传统认知：

• 实验室常用甘油可能损害特定噬菌体（如T4），而微量明胶（0.01%）具有保护作用
• 液氮速冻结合-80°C LB保存可实现跨形态噬菌体的长期稳定（<0.5 log损失）
• 效价下降主要发生在存储首月，提示早期监测可预测长期稳定性

该方案为临床级噬菌体库建设提供了关键技术参数，但需注意缓冲液需符合GMP标准。未来应扩大至Siphovirus等未研究形态，并探索冻干工艺的湿度控制优化。