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本文聚焦亚得里亚海北部的两种形态各异但基因相同的龙须菜（Gongolaria barbata）菌群。通过 16S rRNA 测序，揭示其菌群多样性和宿主特异性。发现环境因素影响藻类菌群结构，为海洋生态系统研究提供关键依据，助力相关保护和管理工作。
引言
在地中海沿海地区，形成藻冠的褐藻（Fucales）是重要的栖息地构建者，比如广义的囊链藻属（Cystoseira sensu lato）物种，它们能构建出繁茂的藻林，为生态系统提供诸多关键服务。然而，人类活动（像沿海建设、污染、沉积物再悬浮）和气候变化（海水温度上升）让这些藻林面临危机，在很多地方逐渐消失，亚得里亚海北部的里雅斯特湾受人为影响，褐藻数量就明显减少。
研究真核生物受环境变化影响时，人们常忽略其与微生物群的相互作用。但根据 “元生物体” 概念，多细胞生物和微生物协同作用，微生物对宿主的健康、繁殖等至关重要。虽然藻类微生物群研究不少，但在藻类多样性和功能潜力方面还有很多未知。对于囊链藻属相关微生物群的研究也较少，其功能和相互作用有待探索。本研究以龙须菜（Gongolaria barbata）为对象，旨在进一步描绘其微生物群落组成，确定宿主特异性，研究两个形态不同种群的微生物群落差异。
材料与方法
研究区域与采样
里雅斯特湾是亚得里亚海北部的半封闭浅湾，长期受人类活动影响。2022 年 4 月，研究人员从该湾的两个采样点采集龙须菜样本。贝尔维德雷（Belvedere）站点的龙须菜种群密集，其顶生叶状体的生殖托短且简单，气胞少或无；梅尔库（Merkur）站点的龙须菜与Cystoseira compressa共生，生殖托长且气胞多。在两个站点，研究人员分别采集了完整藻体、海水和沉积物样本，采样后迅速将样本置于便携式冰箱，30 分钟内送回实验室处理。在实验室中，将藻体各部分细分，海水和沉积物样本也分别进行处理，随后将所有样本存储在 - 80°C 冰箱，等待 DNA 提取。
微生物群落分析
研究人员使用不同试剂盒提取 DNA，如用 DNeasy PowerWater Kit 提取海水样本 DNA，用 DNeasy PowerSoil Kit 提取沉积物样本 DNA，用 DNeasy Plant Pro Kit 提取藻类样本 DNA。然后，利用引物 515F 和 805R 扩增细菌 16S rRNA 基因的 V4 区域，并在 Illumina Miseq 平台测序。
测序数据在 R 软件中进行生物信息学和统计分析。使用 “DADA2” 包对测序数据进行处理，去除低质量序列、去噪、合并配对末端序列，去除嵌合体，保留出现至少两次、长度在 252 - 256bp 的扩增子序列变异（ASVs）。通过 SILVA 数据库（SSU 138.1）进行物种分类注释，利用 “phyloseq” 包进行进一步分析，如制作稀疏曲线、计算多样性指数、进行主坐标分析（PCoA）和置换多元方差分析（PERMANOVA）等，还用 “venn” 包可视化共享 ASVs。
化学分析
溶解有机碳（DOC）和总溶解氮（TDN）分析时，样本经燃烧的 Whatman GF/F 滤膜过滤，用 Shimadzu TOC-L 分析仪测定，以邻苯二甲酸钾和硝酸钾校准，并用深海参考水验证结果。溶解无机营养盐（NH4+、NO2-、NO3-、PO43-）浓度采用分段流动分析法测定，用参考物质进行质量控制，并参与年度校准计划。
图形设计
研究中的图表使用 R Studio 的 “ggplot2” 包绘制，图形摘要用
BioRender.com创建，地图在 ArcGIS 中制作，部分图在 Adobe Illustrator 和 Microsoft Office PowerPoint 中制作，最终用 Inkscape v.1.1 编辑。
结果
藻类相关和环境微生物群落的多样性差异
研究发现，样本中细菌 ASVs 丰富度在 308 - 9742 之间，稀疏曲线表明测序深度能覆盖大部分浮游细菌多样性。部分样本因测序读数少被剔除。不同来源样本（藻类不同部位、海水、沉积物）的 α 多样性指数差异显著。沉积物群落的总物种丰富度（Chao1）和香农多样性指数高于海水群落；藻类相关群落整体多样性低于沉积物，不过固着器和主轴（P）的群落与沉积物物种丰富度相似；藻类相关群落的香农多样性指数和均匀度也低于海水群落，但固着器和主轴（P）除外。在藻类微生物群内，初级分支（V）、生殖托（R）和气胞（A）的群落多样性指数无显著差异，但低于固着器和主轴（P）。两个采样点的细菌群落，除物种丰富度外，α 多样性指数差异不显著，但按藻类部位分组后，固着器和主轴（P）的群落多样性在两个采样点差异显著。
主坐标分析（PCoA）显示，细菌群落组成因样本来源和采样地点而异。固着器和主轴（P）的群落与其他藻类相关和海水群落差异显著。藻类相关微生物群落的分类组成与周围沉积物和海水群落不同，例如，藻类相关群落中酸微菌纲（Acidimicrobiia）相对丰度较高，其中Microtrichaceae家族占比大；而海水群落主要由 α- 变形菌纲（Alphaproteobacteria）主导。
龙须菜的微生物群落
核心微生物群包含 545 个 ASVs，占总 ASVs 的一部分，但在落叶部分（V、A、R）序列比例高，表明藻类相关微生物群宿主特异性低。固着器和主轴（P）微生物群包含的核心 ASVs 较少，且该部位与沉积物共享的独特 ASVs 最多。不同采样点比较发现，贝尔维德雷采样点落叶部分独特 ASVs 较少，两个采样点固着器和主轴（P）与沉积物共享的 ASVs 较多。两个采样点之间，沉积物和固着器及主轴（P）的 ASVs 共享比例较高，落叶部分 ASVs 共享比例较低。
讨论
藻类宿主的形态可塑性不决定微生物群落组成
本研究首次详细描绘了两种表型不同的龙须菜微生物群落。两个采样点的龙须菜虽形态差异大，但基因相同。两个采样点海水化学特征有差异，梅尔库站点沉积物多、水浑浊，贝尔维德雷站点受人为压力小。然而，除固着器和主轴外，两个地点藻类或环境样本的细菌群落 α 多样性指数差异不显著，说明宿主特异性低，两个种群的微生物群落相似。不过，不同部位的 ASVs 共享比例不同，这可能与环境选择压力有关，但也无法排除藻类内在因素的影响，还需进一步研究。
不同藻类部位的微生物群落表现出不同程度的宿主特异性
研究初步表明，龙须菜相关微生物群宿主特异性较低，75% 的藻类相关 ASVs 也存在于核心微生物群中。但落叶部分微生物群落的 α 多样性低于海水和沉积物，这符合之前研究结果，即附生细菌与周围环境微生物群不同，藻类会主动选择相关微生物。固着器和主轴的微生物群落物种丰富度与环境微生物群无显著差异，且与沉积物共享大量 ASVs，推测微生物可能从沉积物水平传播到藻类固着器和主轴，不过这一假设还需后续研究验证。
藻类落叶部分和固着器及主轴部位含有不同的微生物群落
藻类微生物群中，所有藻体部位共有的独特 ASVs 数量少，落叶部分更少，这体现了一定的部位特异性。酸微菌纲和Granulosicoccaceae家族在落叶部分特异性较高，而固着器和主轴与多样的 γ- 变形菌纲（Gammaproteobacteria）群落相关。一些细菌类群如黄杆菌目（Flavobacteriales）在藻类微生物群中重要，但宿主特异性低；还有些细菌类群只与特定藻体部位相关，如 Polyangia 只与气胞相关，Nitrososphaera等只与固着器和主轴相关。本研究与其他关于囊链藻属微生物群落研究结果有差异，可能是由于引物、序列方法、生物信息学流程和参考数据库版本不同。
结论与展望
本研究初步揭示了两种龙须菜种群微生物群落结构的潜在差异，发现环境因素对藻类微生物群落结构有影响，但还需深入分析化学、微生物学和其他环境因素。研究表明龙须菜微生物群宿主特异性较低，基部藻类部位的宿主特异性相对较高。基于这些结果，提出两个假设：一是环境选择压力和藻类内在因素影响微生物群落组成；二是部分藻类微生物群从邻近沉积物群落招募，在藻类生长过程中变得更特殊。未来研究可进一步探究这些假设，明确附生细菌在大型藻类定居、生长和繁殖中的具体作用。
