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本文聚焦废水处理难题，研究发现通过基因工程改造，使芽孢杆菌（Bacillus megaterium）和莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）表达细胞色素 P450 BM3 突变体（P450 BM3 MT35），能有效降解废水中的敌草隆，为治理新兴污染物提供新方向。
### 研究背景
近年来，地表水受农业和城市径流中持久性有机污染物污染日益严重，未经完全处理的废水是农药、除草剂和药物污染物的主要来源。敌草隆作为一种苯基酰胺除草剂，广泛用于控制作物和非作物区域的杂草，常出现在水生生态系统中，是一种内分泌干扰物，被欧盟列为优先有害物质。常规废水处理工艺对敌草隆的去除效率有限，难以达到欧盟规定的饮用水中敌草隆最大允许浓度，因此需要创新且可持续的策略来减轻敌草隆污染。
细胞色素 P450（P450）酶是一类含血红素的蛋白质超家族，在代谢内源性和外源性化合物中起关键作用，可将脂溶性化合物转化为水溶性形式以便排出体外，从而实现对异生物质的解毒。其中，细菌细胞色素 CYP102A1（又称 P450 BM3）因其高催化效率和可溶性等特点，在生物技术应用中颇具潜力。P450 BM3 突变体 MT35 对多种底物具有高效代谢能力，在处理含新兴污染物的废水方面前景广阔。
自然存在的细菌或真菌对药物和农药的体内代谢通常较慢，需要长时间暴露才能实现显著降解，这使得这些方法在废水处理中效果不佳。例如，某些芽孢杆菌和白腐真菌代谢敌草隆的速度缓慢，耗时较长，限制了其在大规模生物修复中的应用。利用转基因微生物进行生物修复成为一种有前景的策略，莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）因其遗传灵活性、易于操作和生物修复潜力而受到广泛研究，其叶绿体是外源基因表达的理想平台。
材料与方法
实验选用芽孢杆菌（Bacillus megaterium，BM，ATCC 14581）、大肠杆菌（Escherichia coli）BL21 细胞、莱茵衣藻（Chlamydomonas reinhardtii）CC - 400（野生型，WT）和 CC - 4388（叶绿体突变体）等菌株。使用的质粒包括 pET28A +、pMM1522、pASapI 等，相关化学试剂用于实验各环节。
构建用于大肠杆菌表达的 P450 BM3 和 P450 BM3 MT35 质粒，将其亚克隆到 pET28A + 载体中，并转化大肠杆菌 BL21 细胞筛选阳性克隆。构建用于芽孢杆菌表达的 P450 BM3 MT35 质粒，经一系列酶切和连接操作后导入芽孢杆菌。为在莱茵衣藻中表达，设计特定质粒，对 P450 BM3 MT35 编码序列进行密码子优化后克隆到 pASapI 载体。
制备芽孢杆菌原生质体，与质粒 DNA 混合后经 PEG - P 处理实现转化。采用特定方法对莱茵衣藻叶绿体进行转化，并通过 PCR 分析和半定量 PCR 分别在 DNA 和 RNA 水平确认突变。
培养含相关质粒的大肠杆菌，诱导表达后经超声破碎、离心等步骤纯化蛋白。莱茵衣藻不同菌株在特定光照和培养基条件下培养，实验前对菌株进行处理和确认，设置不同敌草隆浓度进行实验。
将纯化的 P450 与底物、NADPH 等在特定条件下孵育，反应终止后进行 HPLC 分析，检测代谢产物。使用 Agilent 1200 系列仪器，采用特定的 C18 柱和流动相分离敌草隆及其代谢产物并进行定量分析。
合成废水按照特定配方配制，实际废水样品取自水处理设施，经处理后用于实验。
在液体培养基或废水中培养芽孢杆菌，添加敌草隆后定时取样分析代谢情况。收集莱茵衣藻培养样品，经处理后用质谱仪分析敌草隆含量，计算去除效率。
所有实验至少进行三次独立重复，数据以均值 ± 标准差表示，使用 GraphPad Prism 7 软件进行统计分析，采用两尾 Student's t检验评估组间差异，P≤0.05 视为差异显著。
结果
通过光谱分析，P450 BM3 MT35 在 450nm 处有特征吸收峰，SDS - PAGE 显示其分子量为 118kDa，表明该酶有效表达且能与血红素结合。体外实验中，P450 BM3 MT35 与 NADPH 孵育产生两种主要代谢产物和一种次要代谢产物，经鉴定主要代谢产物为 N - 去甲基化的 DCPMU 和二 N - 去甲基化的 DCPU，未检测到 3,4 - DCA，次要产物身份待确定。
在 TB 培养基中，转基因芽孢杆菌对 10μM 敌草隆的降解迅速，24h 降解 23%，5 天后降解率达 65%，代谢趋于平稳，主要代谢产物为 DCPMU。在合成废水（SWW）和城市废水（MWW）中也能代谢敌草隆，降解率分别达 45% 和 15%，但 MWW 中降解率低于 TB 培养基，野生型芽孢杆菌无代谢敌草隆能力。
莱茵衣藻转化后获得七个阳性菌落，PCR 分析确认 P450 BM3 MT35 成功整合到叶绿体基因组，半定量 PCR 表明转基因株系中 P450 BM3 MT35 有表达。
转基因莱茵衣藻 CrM1 和 CrM2 对高浓度敌草隆耐受性增强，EC50值高于野生型。用 P450 抑制剂利阿唑处理后，转基因株系生长受抑制，与野生型类似，证明 P450 BM3 MT35 表达有助于提高对高浓度敌草隆的耐受性。
CrM1 和 CrM2 对敌草隆的降解效率显著高于野生型，7 天时降解率分别达 50.8% 和 53.3%，添加利阿唑后降解能力下降，表明 P450 BM3 MT35 在增强敌草隆降解中起关键作用。
讨论
本研究成功在芽孢杆菌和莱茵衣藻中表达 P450 BM3 MT35，显著提高了它们代谢敌草隆的能力。体外实验证实该突变体酶活性，生成关键代谢产物且避免产生更有毒的 3,4 - DCA。体内实验中，转基因芽孢杆菌在不同环境基质中均能代谢敌草隆，虽在 MWW 中降解率受影响，但仍优于野生型。
莱茵衣藻表达 P450 BM3 MT35 后，对敌草隆的降解和抗性显著提升，其叶绿体可为 P450 酶提供还原力，是可持续的生物修复平台。敌草隆经 BM3 MT35 代谢产生的代谢产物毒性因环境和生物类型而异，在藻类中这些代谢产物可能毒性较低或被进一步代谢。
芽孢杆菌和藻类系统在生物修复中各有优势，芽孢杆菌能利用多种碳源且适应温度范围广，但存在环境风险，适合在控制的生物反应器中应用；莱茵衣藻可用于户外或大规模水处理，能去除多种污染物。
将转基因藻类应用于工业规模面临挑战，如维持酶稳定表达、优化反应器设计和融入现有污水处理厂基础设施等。藻类固定化技术和类似芽孢杆菌的 containment 策略有助于解决这些问题。未来应开展中试实验评估其可扩展性和实用性，探索监管框架，进行技术经济评估，以推动该技术在工业废水处理中的应用。
综上所述，本研究表明表达 P450 BM3 MT35 的工程微生物在降解敌草隆方面潜力巨大，为受污染水和土壤的生物修复提供了新方向。未来研究应聚焦优化系统，增强酶稳定性和表达，推动基因工程与生物修复技术的融合发展，开发更有效的废水处理技术。
