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本文聚焦内脏利什曼病（VL）诊断难题，研究发现利什曼原虫 Aurora 激酶（LdAIRK）可作为诊断新标记物。经多种检测，其对印度、巴西 VL 患者及印度 PKDL 患者血清检测敏感性高，还能区分既往感染和现症感染，极具应用潜力。
### 研究背景
内脏利什曼病（VL）是一种由利什曼原虫（Leishmania）引起的致命寄生虫病，在印度主要由杜氏利什曼原虫（Leishmania donovani）导致，巴西则主要由婴儿利什曼原虫（Leishmania infantum）引发。世界卫生组织（WHO）数据显示，东非、印度次大陆和巴西是 VL 的主要流行区域。VL 症状与疟疾、登革热等相似，缺乏特异性，实验室诊断存在诸多局限。传统的显微镜检查需侵入性操作且速度慢，直接凝集试验（DAT）、间接免疫荧光（IIF）等方法性能不稳定，分子技术虽特异性高但设备昂贵。rK39 快速诊断试验在印度表现良好，但在其他地区因利什曼原虫菌株基因变异和交叉反应，敏感性和特异性不稳定。因此，寻找新的诊断抗原对提升 VL 诊断水平至关重要。
LdAIRK 的研究基础
蛋白质激酶（PKs）在生物信息学和生物技术发展下成为有潜力的药物靶点。利什曼原虫的激酶组包含 175 - 195 种 PKs，调控细胞周期、分化和毒力等关键功能。研究团队此前发现杜氏利什曼原虫中的 Aurora 样激酶（LdAIRK），它属于有丝分裂丝氨酸 / 苏氨酸激酶家族，在细胞分裂中起关键作用，且在不同利什曼原虫物种间高度保守，这使其成为潜在的治疗靶点和诊断标志物研究对象。
研究方法
- 样本收集：研究共使用 231 份人类血清样本，其中 147 份来自印度的相关机构，包括 79 例活动期 VL 患者、16 例黑热病后皮肤利什曼病（PKDL）患者、14 例地方健康对照和 33 例非地方健康对照，还有 14 例其他疾病患者；25 份来自印度健康志愿者；40 例巴西 VL 患者和 19 例巴西健康对照样本从巴西收集后冷冻运输至印度保存。样本通过 rK39 筛查和寄生虫学显微镜检查或皮肤标本 PCR 确认诊断，排除孕妇、HIV 或 COVID - 19 合并感染等人群。
- LdAIRK 的克隆、表达与纯化：从杜氏利什曼原虫 AG83 菌株获取 LdAIRK 基因，插入 pET28a 载体，在 Rosetta (DE3) 大肠杆菌菌株中表达。通过诱导剂异丙基 - β - D - 1 - 硫代半乳糖吡喃糖苷（IPTG）诱导表达，收集细胞裂解物，经超声破碎、离心获取包含体，再用尿素溶解，通过镍 - 氮川三乙酸（Ni - NTA）琼脂糖基质亲和层析纯化，透析复性并浓缩，用十二烷基硫酸钠 - 聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS - PAGE）和考马斯亮蓝染色验证纯度，Lowry 法测定蛋白浓度。
- 免疫检测方法：免疫印迹试验将蛋白转移到硝酸纤维素膜上，用血清中的一抗和辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗孵育，化学发光底物显色后用凝胶成像系统分析。酶联免疫吸附试验（ELISA）将重组 LdAIRK 抗原包被在 96 孔板，依次加入血清样本、二抗，用四甲基联苯胺（TMB）底物显色，酶标仪测定 450nm 吸光度检测特异性 IgG 抗体。制备硝酸纤维素膜基的免疫层析试纸条，在测试线和对照线分别包被 LdAIRK 和兔抗人 IgG，与血清样本反应后用酶标二抗显色，观察测试线和对照线颜色判断结果。侧向流动试验（LFT）在硝酸纤维素膜上分别包被 LdAIRK 和蛋白 G，组装成检测卡，加入血清样本和缓冲液，观察膜上显色条带，与商业化 rK39 检测条对比结果。
- 数据分析：使用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析，通过受试者工作特征曲线（ROC）分析确定 LdAIRK ELISA 的临界值、敏感性和特异性，计算曲线下面积（AUC）评估诊断准确性，用曼 - 惠特尼 U 检验判断差异显著性，P < 0.05 为差异有统计学意义。
研究结果
- LdAIRK 的克隆与表达成功：LdAIRK 基因大小为 906bp，编码 301 个氨基酸，分子量约 36kDa。PCR 扩增和克隆后，成功表达并纯化出 LdAIRK 蛋白，SDS - PAGE 显示纯化蛋白条带清晰，分子量符合预期。
- 免疫印迹试验结果：免疫印迹试验中，LdAIRK 与 VL 患者血清样本有强阳性反应，在 36kDa 处出现明显条带；与健康对照和其他疾病样本无反应（除阳性对照 VL 样本外），表明其对 VL 患者血清抗体有特异性识别能力。
- ELISA 试验结果：ELISA 检测印度 VL 患者血清样本敏感性达 98.73%（95% CI：93.17 - 99.94），PKDL 患者为 93.75%（95% CI：71.67 - 99.68），巴西 VL 患者为 97.5%（95% CI：86.84 - 99.94）；印度健康对照特异性为 94.33% - 94.74%，巴西健康对照为 84.21%。AUC 值显示 LdAIRK 对 VL、PKDL 和巴西血清样本的诊断性能良好，接近 0.98，且 VL 患者抗体水平与健康对照和其他疾病患者差异显著。
- 治疗后随访样本检测结果：对印度患者治疗 6 个月后的随访血清样本进行 ELISA 分析，发现 LdAIRK 特异性抗体水平显著下降，仅 8.3% 的样本呈阳性，表明该检测可用于监测治疗反应，但还需更多纵向研究评估其预后潜力。
- 试纸条和 LFT 检测结果：试纸条检测印度和巴西 VL 血清样本敏感性均为 100%，印度健康对照特异性为 100%，巴西健康对照为 84.21%，印度 PKDL 样本敏感性为 83.3%。LFT 检测印度和巴西 VL 样本敏感性均为 100%，对印度 PKDL 样本敏感性优于 rK39（100% vs 80%），但在健康对照中存在一定交叉反应，特异性为 87.5%（印度）和 84.21%（巴西）。总体而言，LdAIRK - LFT 在印度 VL 和 PKDL 样本诊断上表现出良好前景。
讨论
现有 VL 快速诊断试验存在局限性，rK39 等商业检测在不同流行区域性能不稳定，且无法用于治疗后监测。本研究评估 LdAIRK 作为诊断抗原的性能，其在印度和巴西 VL 及印度 PKDL 患者血清样本检测中表现出高敏感性和一定特异性，在不同检测方法中均有良好表现。与其他基于驱动蛋白的抗原相比，LdAIRK 具有独特优势，尽管在巴西健康对照样本中存在交叉反应，但仍有潜力成为全球不同流行区域 VL 诊断的有效工具。同时，LdAIRK 在治疗后抗体水平下降明显，优于 rK39，可用于区分近期和既往感染，但还需进一步研究，如扩大样本量、纳入更多流行区域样本、深入分析 IgG1 抗体水平变化等。本研究虽有局限性，但为 VL 诊断和治疗监测提供了新方向，对控制这一热带病、推进全球健康覆盖目标具有重要意义。
