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本文开发了三种数字 droplet PCR（ddPCR）检测方法，用于测量沃尔巴克氏体（Wolbachia）的总丰度、基于 DNA 提取效率校正的丰度及相对于宿主基因组拷贝的密度。这些方法灵敏度高，能检测罕见的Wolbachia，将推动Wolbachia - 宿主互作研究。
### 研究背景
沃尔巴克氏体（
Wolbachia）是广泛存在于动物细胞内的微生物，尤其是昆虫，它能影响宿主生殖、为宿主提供营养补充，还能抑制病原体复制，在控制蚊媒疾病方面极具潜力。
Wolbachia相关性状的强度与它在宿主细胞内的数量有关，因此准确测量其丰度对研究宿主 - 微生物互作及疾病控制意义重大。
传统测量Wolbachia丰度的方法是定量聚合酶链反应（qPCR），但 qPCR 在检测罕见Wolbachia时存在灵敏度不足的问题，还容易受 PCR 扩增效率和背景噪声影响，导致结果不准确。数字 droplet PCR（ddPCR）则更为灵敏，能有效检测罕见目标，且不受 PCR 效率变化的影响。
研究目的
开发适用于更广泛Wolbachia菌株和宿主系统的 ddPCR 检测方法，以准确测量Wolbachia的丰度、密度等指标，为研究Wolbachia - 宿主相互作用提供更有效的工具。
实验设计
- 昆虫品系及饲养：实验选用含有和不含有wMel Wolbachia的黑腹果蝇（D. melanogaster）品系，饲养在特定条件下，定期检测Wolbachia的细胞型。
- 样本采集与 DNA 提取：随机选取果蝇，经匀浆后用 QIAwave DNA Blood & Tissue Kit 提取 DNA，通过 NanoDrop OneC分光光度计检测 DNA 质量，不合格样本排除。部分实验会添加 DNA spike - in control。
- ddPCR 引物和探针设计：设计两组引物和探针，一组针对Wolbachia的单拷贝基因ftsZ，另一组针对果蝇属中的单拷贝 “超保守元件”mid1。根据一系列筛选标准设计引物和探针，并进行特异性测试。
- 构建Wolbachia系统发育树：从相关基因组中鉴定单拷贝直系同源基因，经拼接、比对后用 RevBayes 构建系统发育树。
- ddPCR 实验：设置不同的反应体系，包括单重和双重反应，反应后生成液滴，进行 PCR 扩增，最后用液滴读取器分析，样本产生液滴少于 10,000 个则排除。
- 数据分析与绘图：用 QX Manager 软件计算目标浓度和置信区间，R 语言进行相关性分析，“ggplot2” 包绘图，Inkscape 修改图形美观度。
实验结果
- 单重 ddPCR 检测Wolbachia绝对丰度：设计的ftsZ - ddPCR 引物和探针基于 106 个 A 超群Wolbachia菌株的序列。在 6°C 温度范围内评估其性能，发现 60°C 适合区分阳性和阴性液滴。该检测方法特异性强，灵敏度高，在 1:10 稀释系列中能准确检测ftsZ，估计检测限（LoD）约为每 20 μL 反应 12 个ftsZ拷贝。
- 双重 ddPCR 检测Wolbachia密度：设计的mid1 - ddPCR 引物和探针可有效检测mid1。双重ftsZ/mid1 - ddPCR 检测能成功区分不同液滴组，在 1:10 稀释系列中灵敏度高，ftsZ和mid1的 LoD 分别约为每 20 μL 反应 7 个和 5 个拷贝。
- 双重 ddPCR 检测校正效率后的Wolbachia绝对丰度：开发的ftsZ/spike - ddPCR 检测可同时定量ftsZ和 DNA spike - in control。该检测方法在 60°C 能有效区分阳性和阴性液滴，特异性强，在 1:10 稀释系列中灵敏度高，ftsZ和 spike - in control 的 LoD 约为每 20 μL 反应 6 个拷贝。
研究结论
- 检测方法的优势与局限性：开发的三种 ddPCR 检测方法可有效检测Wolbachia，但各有优缺点。ftsZ - 和ftsZ/spike - ddPCR 可进行绝对定量，ftsZ检测简单便宜，ftsZ/spike - ddPCR 可校正 DNA 纯化效率；ftsZ/mid1 - ddPCR 可标准化Wolbachia丰度，但mid1引物仅适用于特定物种，且存在一些假设条件限制。
- 检测限与精度：这些检测方法能可靠检测低至 7 - 12 个Wolbachia基因拷贝，LoD 受假阳性率和检测能力影响，实验时需注意环境清洁，建议报告实验特定的 LoD。低浓度时检测精度会略有下降，可通过重复实验提高精度。
- 应用前景：这些检测方法适用于研究Wolbachia - 宿主相互作用，尤其是在检测罕见Wolbachia方面优势明显，有望推动相关领域研究进展。但应用于其他Wolbachia菌株时需先进行初步试验。
