探秘金黄色葡萄球菌 VraS 组氨酸激酶单点突变影响抗生素耐药机制，解锁抗菌新策略

这篇研究聚焦金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）。通过酶动力学、微生物学和转录组分析，揭示 VraS 组氨酸激酶 T331I 单点突变增强其催化效率，使细菌对细胞壁靶向抗生素耐药，对理解耐药机制及开发新药意义重大。

　　### 研究背景
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）是引发多种严重感染的重要病原菌，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）更是医院和社区感染的主要元凶。2020 年，美国 MRSA 感染率较 2019 年增加 13%。在治疗上，美国感染病学会推荐万古霉素或达托霉素作为一线用药。

MRSA 的耐药表型常源于获得性耐药基因，如mecA。而万古霉素中介金黄色葡萄球菌（VISA）的出现，则与基因组多个位点的突变有关，这些突变多是环境压力（如抗生素暴露）下的适应性反应，且 VISA 的双组份系统（TCSs）网络也存在突变。

TCSs 在细菌中具有多种重要功能，像 VraSR、WalKR 和 GraSR 等参与细胞壁生物合成。其中，VraSR 可对糖肽类或 β- 内酰胺类抗生素产生应答，VraS 组氨酸激酶能磷酸化应答调节蛋白 VraR，进而激活相关基因，帮助细菌抵御细胞壁抑制性抗生素。已有研究表明，万古霉素暴露可上调 VraSR 表达，增强金黄色葡萄球菌的细胞内存活能力，且vraSR调控子中的多个点突变与 VISA 相关。

VraS 属于内膜感应组氨酸激酶家族，其 ATP 结合域参与自身磷酸化过程，该区域突变与抗生素耐药性增强有关。此前有研究发现，对感染性心内膜炎患者长期使用达托霉素治疗，会使敏感的金黄色葡萄球菌产生耐药性，且临床分离株中出现 VraS T331I 突变。本研究旨在进一步探究该突变对金黄色葡萄球菌耐药机制的影响。

实验方法

1. 菌株、培养基和试剂：使用 Fisher Scientific 等公司的化学试剂，实验菌株包括金黄色葡萄球菌纽曼 D2C 菌株（ATCC #25904）及其等基因 VraS T331I 突变株，还有大肠杆菌 BL21 (DE3) pLysS 等，菌株保存于 LB 培养基，37°C 培养。
2. 质粒构建：从 pGEX-VraS 质粒扩增 His 标签的 VraS 片段，经酶切、连接构建 pET15b-VraS 质粒，再通过定点突变引入 T331I 突变，构建 pET15b-VraS T331I 质粒，经测序确认。
3. 蛋白表达与纯化：将构建好的质粒转化到 BL21 (DE3) pLysS 细胞中，诱导表达后，经 Ni-NTA 亲和层析和尺寸排阻层析纯化蛋白，用牛血清白蛋白作标准测定蛋白浓度。
4. 酶活性测定：采用动力学偶联测定法检测 VraS 和 T331I 突变体的自磷酸化反应速率，通过监测 NADH 吸光度变化计算反应速率；以不同浓度 ATP 测定米氏动力学常数。
5. 突变菌株构建：运用重组工程结合 CRISPR-Cas9 反选择技术，将 C992T 点突变引入vraS基因，构建 VraS T331I 金黄色葡萄球菌突变株，经筛选和测序确认。
6. 药敏试验：依据欧洲抗菌药物敏感性试验委员会指南，采用肉汤微量稀释法，在阳离子调整的 Muller-Hinton 肉汤（CAMHB）和 LB 培养基中，测定万古霉素、甲氧西林和达托霉素对野生型（WT）和突变菌株的最小抑菌浓度（MIC）。
7. 浓度 - 反应和生长动力学研究：在 CAMHB 培养基中进行剂量反应研究，测定不同药物浓度下细菌的 CFU/mL；在 LB 培养基中，利用微孔板读数仪测定 WT 和突变菌株 24 小时内 OD₆₀₀值，计算生长速率，实验重复两次，每次三个重复。
8. 定量实时逆转录 PCR（qRT-PCR）：培养菌株至 OD₆₀₀为 0.6，添加抗生素处理 1 小时后提取总 RNA，合成 cDNA 进行 qRT-PCR，以 50S 核糖体蛋白 L4（rplD）为内参，用 2^?ΔΔCt方法计算基因表达水平，用 Prism 10 软件统计分析。
9. RNA 测序（RNA-seq）分析：提取四个样本（WT + 万古霉素、突变体 + 万古霉素、WT 对照、突变体对照）的总 RNA，送 Novogene 公司进行数字基因表达（DGE）分析，以 Newman 基因组为参考，计算基因表达量，筛选差异表达基因（DEGs），并用 qRT-PCR 验证。

实验结果

1. VraS T331I 突变提高自磷酸化速率和催化效率：T331I 突变体的自磷酸化速率达到 223.73 ± 5.6 nmol h^?1，约为 WT 酶（19.03 ± 1.1 nmol h^?1）的 12 倍。虽然突变体对 ATP 的亲和力（K_M）变化不显著，但催化速率（k_cat）从 32.02 ± 3.7 h^?1提升到 170.70 ± 2.3 h^?1，催化效率（K_M / k_cat）提高了三倍多。
2. 突变影响 MIC、药物疗效和效力：将 T331I 突变引入纽曼 WT 菌株基因组后，多数测试抗生素的 MIC 增加两倍。浓度 - 反应研究显示，突变菌株对所有抗生素的 EC₅₀有升高趋势，虽与 WT 菌株相比，抗生素疗效（E_max）和效力（EC₅₀）无显著差异，但仍表明vraS突变在抗生素耐药中可能发挥作用。
3. 突变改变金黄色葡萄球菌生长动力学：在无抗生素时，T331I 菌株与 WT 菌株生长动力学相似；但在抗生素存在下，T331I 突变体生长更快、延迟期更短、耐受性更强。
4. 突变影响相关基因表达：在无抗生素压力下，T331I 菌株blaZ基因表达比 WT 菌株高 6.5 倍；经不同抗生素处理后，T331I 菌株blaZ基因表达均显著高于 WT 菌株，pbp2基因表达则在不同抗生素处理下有不同变化。
5. 突变导致转录组变化：RNA-seq 分析表明，无压力时，T331I 菌株有 70 个差异表达基因（DEGs）；万古霉素处理后，WT 菌株有 287 个 DEGs，T331I 突变体有超过 1200 个 DEGs，且突变体中超过 450 个基因（约占基因组的 14%）表达变化超过两倍，约 3% 变化超过四倍，涉及核糖体、氨基酸代谢等多条通路。
6. 突变改变蛋白 - 蛋白相互作用网络：STRING 分析显示，在抗生素压力下，WT 菌株中 VraS 有核心相互作用；T331I 突变体在无抗生素时，VraS 保留核心相互作用，VraR 出现新相互作用；突变体经万古霉素处理后，蛋白 - 蛋白相互作用网络更复杂，VraS 和 VraR 与其他双组份系统出现新相互作用。

研究讨论

本研究发现，VraS 的 T331I 突变显著影响其催化活性，使自磷酸化速率和催化效率大幅提升。这是因为该突变位于 ATP 结合位点附近，影响了酶活性和 ATP 消耗，进而上调细胞壁合成基因和其他调节基因。

生长动力学曲线表明，突变菌株在药物存在下具有优势，其blaZ基因高表达产生的 β- 内酰胺酶能水解抗生素，恢复细菌生长。

不同抗生素处理下，vraR和pbp2基因表达变化不同，T331I 菌株对达托霉素处理时这两个基因表达增加，解释了携带该突变的临床分离株对达托霉素的耐药性；而blaZ基因表达变化则解释了对 β- 内酰胺类抗生素的耐药性。

T331I 突变体的差异基因表达涉及多个通路，如核糖体和肽聚糖生物合成等，表明vraS突变不仅影响细胞壁调节，还影响细菌代谢，进而影响抗菌药物敏感性。其中，treP和isaA基因上调可能与突变体耐药表型有关，而hisD、cwrA等基因下调则与细菌代谢改变和毒力减弱相关。

蛋白 - 蛋白相互作用网络预测显示，VraSR 与其他基因存在相互作用，T331I 突变体中 VraSR 与其他双组份系统在万古霉素压力下可能发生信号串扰，增强细菌的耐受性，但这些预测还需进一步实验验证。

综上所述，VraS 的 T331I 突变通过多种机制增强金黄色葡萄球菌对糖肽类和 β- 内酰胺类抗生素的耐药性。靶向 VraS 的 ATP 结合域可能是对抗耐药金黄色葡萄球菌感染的有效策略，未来还需开发针对这些突变体的特异性抑制剂，以解决金黄色葡萄球菌的耐药问题。