志贺氏菌候选疫苗 1790GAHB：激发蛋白特异性免疫反应，探寻潜在疫苗靶点

志贺氏菌（Shigella）是导致儿童腹泻发病和死亡的重要原因。本文通过对多项临床试验血清样本的研究，发现基于通用膜抗原模块（GMMA）的 1790GAHB 候选疫苗能引发抗蛋白抗体反应，还确定了 7 种与保护相关的蛋白，为疫苗研发提供方向。

　　### 引言
志贺氏菌（Shigella spp.）是一类经粪口途径传播的肠道致病菌，可引发从轻度自限性腹泻到严重细菌性痢疾等多种症状。在全球范围内，它是导致腹泻发病和死亡的主要原因之一，尤其对 5 岁以下生活在低收入和中等收入国家（LMICs）的儿童危害极大，每年近 10 万名儿童因感染死亡。此外，免疫缺陷人群、男男性行为者和前往志贺氏菌流行国家的旅行者也属于易感人群。

目前已发现 4 种志贺氏菌，其中福氏志贺菌（S. flexneri）和宋内志贺菌（S. sonnei）导致了全球近 90% 的志贺菌病。福氏志贺菌在 LMICs 中最为常见，而宋内志贺菌在高收入国家更为流行。近年来，在 LMICs 的工业化地区，宋内志贺菌有逐渐取代福氏志贺菌的趋势。

开发安全有效的疫苗是控制志贺菌病的关键，但目前尚无广泛可用的许可疫苗。人们认为针对志贺氏菌的免疫反应具有血清型特异性，主要由脂多糖（LPS）中的 O 抗原（OAg）介导。因此，OAg 一直是疫苗研发的主要靶点。不过，侵袭性质粒抗原（Ipa）蛋白和毒力（Vir）因子等也是潜在的免疫靶点。

1790GAHB 候选疫苗是一种基于通用膜抗原模块（GMMA）的疫苗，其开发为设计针对多种志贺氏菌血清型的改良疫苗奠定了基础。蛋白质微阵列技术已被成功用于分析免疫反应和识别保护性免疫特征。本研究旨在评估 1790GAHB 疫苗引发抗蛋白反应的能力，并分析相关免疫反应与预防志贺菌病的关系。

材料和方法

1. 临床研究和血清样本：本研究对 4 项临床试验（H03_01TP、H03_01E1TP、H03_03TP 和 H03_04TP）中的血清样本进行了蛋白质组学分析。这些样本来自不同地区的成年人，包括非流行区（法国）、流行区（肯尼亚）以及美国的一项人体挑战试验。样本在不同时间点采集，包括基线（接种前）、每次接种后以及 H03_03TP 研究中的攻毒前后。
2. 蛋白质微阵列构建：由 Antigen Discovery, Inc. 生产志贺氏菌全蛋白质组微阵列，针对 3150 种全长或片段化蛋白质构建克隆文库，这些蛋白质代表了志贺氏菌的核心蛋白质组和各物种特异性蛋白质。
3. 探针实验：利用基于大肠杆菌的体外转录和翻译（IVTT）系统表达蛋白质，并将其打印到硝酸纤维素包被的玻片上。血清样本稀释后与微阵列孵育，随后用标记的抗体进行检测，以分析血清中抗体与蛋白质的结合情况。
4. 基线稀释实验：为确定血清样本的最佳稀释度，用肯尼亚 H03_04TP 试验的基线样本进行稀释实验。结果表明，1:100 的稀释度适用于所有实验。
5. 微阵列信号量化：使用 GenePix 4300A 高分辨率微阵列扫描仪扫描玻片，通过特定软件定义阵列布局并量化信号。将原始信号强度进行对数 2 转换并归一化处理，以评估抗体与蛋白质的特异性结合。
6. 统计分析：通过定义血清阳性阈值进行反应性筛选，计算多种统计指标评估免疫反应。使用 Spearman 等级相关系数评估血清中宋内志贺菌 LPS IgG 水平与微阵列斑点归一化强度之间的关联。所有数据处理和分析由 Antigen Discovery, Inc 使用 R 软件完成。

结果

1. 1790GAHB 疫苗接种后识别的抗原：在 H03_01TP 试验及其扩展试验中，大多数接种 1790GAHB 的成年人随着时间推移，针对志贺氏菌蛋白抗原的 IgG 水平升高，在第 85 天（第三次接种后 28 天）达到峰值。多个蛋白的 IgG 反应显著增加，如 T3SS 脂伴侣家族蛋白、假定的外膜脂蛋白 Wza 等。H03_01E1TP 研究中的加强接种后，部分蛋白的 IgG 反应进一步增强。IgA 反应方面，仅在 H03_01E1TP 研究中，假定的外膜脂蛋白 Wza 的 IgA 水平在部分参与者中从基线到第 29 天有≥50% 的增加。

在 H03_03TP 研究中，接种 1790GAHB 的参与者有 8 个阵列斑点的 IgG 水平从第 1 天到第 57 天有≥50% 的增加，其中 7 个斑点的增加具有统计学意义，但多重检验校正后仅假定的外膜脂蛋白 Wza 的增加仍显著。该研究中，有一个对应血凝素家族蛋白 / 黏附素的阵列斑点，其 IgA 水平在部分参与者中有≥50% 的增加。

在 H03_04TP 研究中，100 μg 组的 IgG 水平总体高于 25 μg 组。10 个阵列斑点在 100 μg 组的部分参与者中有≥50% 的 IgG 水平增加，9 个具有统计学意义，但多重检验校正后均不显著。T3SS 脂伴侣家族蛋白在所有三项研究中都是最具反应性的阵列斑点。在 25 μg 组中，对应血凝素家族蛋白 / 黏附素的阵列斑点有≥50% 的 IgA 水平增加，而 100 μg 组未观察到。
2. H03_03TP 研究中与攻毒后保护相关的抗原特异性反应：在接受志贺氏菌攻毒的成年人（接种疫苗或安慰剂）中，7 个阵列斑点（对应 5 种侵袭性质粒抗原 IpaB、IpaD、IpaA、IpaH、IpaC，以及侵袭性质粒基因 C IpgC 和外膜 MxiD 蛋白）的 IgG 信号在攻毒后增加，其中接种 1790GAHB 的参与者中，IpaB 和 IpaH 的反应增加具有统计学意义，安慰剂组中 IpaB、IpaD、IpaA、IpaH 和 IpaC 的反应增加显著。

按攻毒结果（患志贺菌病与否）分层后，安慰剂组中 IpaB、IpaH 和 IpaD，以及 1790GAHB 组中 IpaB、IpaH、IpaD、IpaC 和 IpaA 的预攻毒 IgG 水平越高，患志贺菌病的风险越低。疫苗组中 9 种蛋白、安慰剂组中 2 种蛋白的反应曲线下面积大于 0.70。排除 IpaB 后，预攻毒时更高的 IgG 反应仍与降低的志贺菌病风险相关。
3. 基于不同暴露环境的微阵列基线反应性：比较肯尼亚和美国的基线数据，发现 21 种抗原在肯尼亚参与者中的反应性更高。其中前 6 种最具反应性的蛋白（IpaC、IpaB、IpaA、IpaD、IpaH 和 IpgC）也与美国 H03_03TP 研究中参与者攻毒后的 IgG 反应增加有关。在法国的 H03_01TP 研究中，除了肽聚糖相关脂蛋白外，基线时未观察到其他阵列斑点有高 IgG 抗体结合。
4. 微阵列数据与宋内志贺菌 LPS IgG 血清抗体水平的相关性：在 H03_01TP 研究及其扩展试验中，抗 LPS IgG 水平的增加与微阵列斑点的 IgG/IgA 反应增加相关，如 T3SS 脂伴侣家族蛋白、假定的外膜脂蛋白 Wza 等。在 H03_03TP 研究的 25 μg 组中，假定的外膜脂蛋白 Wza 也与 IgG 蛋白反应和 ELISA 数据有较高相关性。

讨论

GMMA 被认为是一种创新的志贺氏菌 OAg 递送系统，1790GAHB 候选疫苗已在多项临床试验中显示出能引发抗 LPS IgG 反应和杀菌活性。本研究利用蛋白质组微阵列评估了其引发的抗蛋白反应。

研究发现，接种 1790GAHB 后，部分免疫原性蛋白在不同研究中重叠，如 T3SS 脂伴侣家族蛋白、主要外膜脂蛋白 Lpp 和假定的外膜脂蛋白 Wza。这些蛋白的 IgG 反应具有剂量依赖性，且后续接种有累积效应。

在人体挑战试验中，7 种 T3SS 蛋白（IpaB、IpaD、IpaA、IpaH、IpaC、MxiD 和 IpgC）的 IgG 反应在攻毒后增加，且预攻毒时这些蛋白的 IgG 反应与未患志贺菌病相关，表明它们可能与临床保护有关。其中，MxiD 和 IpgC 是首次被确定为潜在的疫苗开发抗原。

虽然一些 GMMA 相关蛋白具有免疫原性，但它们与保护作用无关。不过，GMMA 仍是一种有吸引力的疫苗平台，因其生产成本低、纯化产量高。另外，本研究还发现 21 种志贺氏菌抗原在肯尼亚参与者中的反应性更高，主要是 T3SS 蛋白，进一步证实了 T3SS 侵袭性质粒作为交叉保护性疫苗抗原的潜力。

本研究存在样本量相对较小和未监测自然暴露等局限性。但总体而言，研究确定了 7 种与高抗体反应和保护相关的蛋白，为未来疫苗开发提供了潜在靶点。未来疫苗开发可考虑将 GMMA 作为 OAg 递送系统与这些潜在保护性 T3SS 蛋白结合。