复苏促进因子（Rpf）：解锁土壤细菌休眠密码，重塑生态多样性

本文聚焦土壤细菌休眠与复苏现象，研究发现复苏促进因子（Rpf）可终止多种土壤细菌休眠。通过对来自农业土壤的 Micrococcus KBS0714 菌株的 Rpf 进行研究，揭示其与细菌系统发育、细胞包膜特征及功能性状的关联，为理解土壤微生物多样性和生态系统功能提供新视角。

　　

引言

土壤是地球上微生物多样性最为丰富的栖息地之一，每克土壤中可能存在数千种共生的微生物类群。在土壤环境中，微生物常面临不利于生长和繁殖的条件，为了生存，许多微生物会进入休眠状态。休眠是指微生物个体进入一种代谢活动降低的可逆状态，土壤中仅有约 1% 的微生物生物量处于代谢活跃状态，其余大部分形成 “种子库”。这一休眠微生物的 “种子库” 对种群的进化和存续、生物多样性的维持以及生态系统的整体功能都至关重要。

微生物进入休眠状态的机制多种多样，且独立进化多次。例如，一些丝状蓝藻在光照或磷限制时会形成称为厚壁孢子（akinetes）的休眠结构；真菌孢子的产生部分由丛枝菌根与植物宿主之间的激素信号引发；部分细菌则通过形成代谢不活跃的持留菌（persister cells）进入休眠，这些持留菌可随机产生或在不利环境条件下生成。

对于微生物而言，从休眠中复苏同样关键。因为在不恰当的时间苏醒可能不利于生存，所以微生物通常依赖各种信号来决定复苏时机。在放线菌门（Actinomycetota）细菌中，存在一种名为复苏促进因子（Rpf）的胞外酶，可帮助细菌从休眠中复苏。Rpf 最初在藤黄微球菌（Micrococcus luteus）群体中被发现，它能水解细菌细胞壁肽聚糖中的 β-(1,4) 糖苷键，不仅有助于休眠细胞壁的重塑和更新，促进细菌生长，而且水解过程中释放的胞壁肽还可能作为信号分子，唤醒与之密切相关的细菌。Rpf 在放线菌门的多个类群中广泛分布，在临床方面，它能终止结核分枝杆菌（Mycobacterium）等菌株的潜伏期。此外，环境分离物中也存在 Rpf，在土壤中，高达 20% 的土壤基因组可能含有 Rpf 同源物，其对土壤种子库动态可能有直接或间接的影响，但目前对土壤来源的 Rpf 如何影响不同菌株的细菌了解较少。本研究以从农业土壤中分离的放线菌菌株 Micrococcus KBS0714 为材料，对其产生的重组 Rpf 展开实验研究，旨在探究该 Rpf 的催化特性、对不同土壤细菌复苏动态的影响，以及其与土壤休眠相关功能性状的关系。

结果

1. Rpf 是一种高亲和力酶：研究人员通过使用荧光标记的肽聚糖，对来自 Micrococcus KBS0714 的纯化重组 Rpf 进行酶动力学分析。利用 Michaelis-Menten 函数进行拟合，结果显示，该 Rpf 的最大催化速率（Vmax）为 59 单位荧光素 /min，米氏常数（Km）为 1.8mg 肽聚糖 /mL?min。较低的Km值表明 Rpf 对肽聚糖具有较高的亲和力，能够在低底物浓度下催化反应，这在复杂多变的土壤环境中具有重要意义。
2. Rpf 对生长的影响具有浓度依赖性：为了研究 Rpf 对细菌生长的刺激或抑制作用，研究人员将处于休眠状态的 Micrococcus KBS0714 细胞在含有不同浓度（0 - 6μM）重组 Rpf 的新鲜培养基中培养，并测定其生物量。结果发现，随着 Rpf 浓度的增加，细菌生物量呈单调上升趋势，符合 Monod 生长模型。该模型的半饱和常数（Ks）为 2.1μM Rpf，估计的最大生物量（OD₆₀₀）为 2.3。在本研究测试的浓度范围内，未观察到 Rpf 对 Micrococcus KBS0714 生长的抑制作用。
3. Rpf 突变破坏复苏过程：对 Micrococcus KBS0714 的 Rpf 基因进行定点突变，改变其保守催化位点（E54）。当将谷氨酸（E）突变为丙氨酸（A）时，重组 Rpf 对细菌生物量几乎没有影响；突变为赖氨酸（K）时，复苏率降低 40%；突变为谷氨酰胺（Q）时，复苏率降低 25%，但生物量仍显著高于无 Rpf 的对照组。此外，研究还发现 Micrococcus KBS0714 的 Rpf 在氨基酸序列上与模式菌株 Micrococcus luteus（Fleming）存在差异，其在溶菌酶样结构域和 LysM 结构域之间的凝集素编码连接区含有较多重复基序。删除该可变连接区及 LysM 结构域后，Rpf 的活性降低超过 50%，几乎完全消除了对休眠细菌的复苏作用，表明这些区域对 Rpf 的功能至关重要。
4. Rpf 改变种群动态：研究人员对处于休眠状态的 Micrococcus KBS0714 群体添加重组 Rpf，观察其种群动态变化。结果显示，添加 Rpf 使细菌的滞后期缩短了 37%，从 476 ± 27.1 小时降至 298 ± 3.4 小时，使得实验复苏的种群比对照种群提前约 7.5 天进入指数生长期。然而，Rpf 对细菌的最大生长速率（μmax）和生物量产量没有显著影响。此外，Rpf 还显著降低了重复种群间μmax和滞后期的变异性，表明 Rpf 可能使复苏相关过程更加同步化，减少随机事件对种群再生的干扰。
5. 多种细菌受 Rpf 影响：研究人员选取了 12 种具有不同进化历史的土壤细菌，评估它们对 Micrococcus KBS0714 重组 Rpf 的响应。通过测定生长曲线参数，并计算标准化的 Rpf 效应大小，发现菌株与 Rpf 处理之间在生长产量和μmax上存在显著的交互作用。进化关系在一定程度上可以解释这种差异，例如，Rpf 对μmax的效应大小存在明显的系统发育信号。同时，细胞包膜的关键特征也与细菌对 Rpf 的响应差异有关，革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌对 Rpf 的反应不同，Rpf 对革兰氏阴性菌的μmax和生长产量的影响分别比对革兰氏阳性菌大 3.2 倍和 6.2 倍。此外，细菌对 Rpf 的响应还与功能性状相关，复苏情况与细菌的水分生态位特征密切相关，例如，Rpf 对μmax和生长产量的效应大小随最小水势（Wmin）的增加而线性增加，随生态位宽度（b）和最适水势（Wopt）的增加而线性减小。Rpf 对滞后期的效应大小与生物膜产生呈正相关，生物膜的产生可能与细菌对干燥胁迫的耐受性有关。

讨论

1. Rpf 的动力学和催化作用：Rpf 最初被认为是一种细菌细胞因子，能在皮摩尔浓度下复苏藤黄微球菌的休眠培养物。然而，本研究中观察到 Micrococcus KBS0714 的 Rpf 在微摩尔浓度下发挥作用，这与其他环境分离物的报道一致。Rpf 的低Km值表明其对肽聚糖具有很强的结合能力，即使在底物浓度较低的土壤环境中也能有效发挥作用。虽然 Rpf 通常被认为具有促进生长的作用，但它也可能产生抑制效果，如高浓度的 Rpf 会导致红球菌（Rhodococcus）的活细胞密度下降。不过，在本研究的活细胞实验中，未观察到 Rpf 的抑制作用，Micrococcus KBS0714 的生长随 Rpf 浓度增加而增加，直至 6μM，但更高浓度的 Rpf 在土壤环境中的生态相关性尚不清楚。
2. Rpf 功能的遗传保守性：Rpf 基因保守区域的定点突变对细菌复苏有显著影响。Rpf 催化结构域中 N 端的谷氨酸残基（E54）对其溶壁活性至关重要，突变该位点会显著降低或消除重组 Rpf 对休眠 Micrococcus KBS0714 的复苏能力。此外，蛋白质序列中其他区域的突变，如凝集素编码连接区的重复基序和 LysM 结构域的突变，也会影响复苏过程。这些重复基序可能源于串联重复，对 Rpf 的功能具有重要意义，可能增强其与肽聚糖的结合能力，进而影响 Rpf 在复杂土壤环境中的复苏功能。
3. 复苏细菌的种群动态：Rpf 的一个重要特征是能够缩短休眠种群复苏后的滞后期。本研究中，重组 Rpf 使 Micrococcus KBS0714 的滞后期显著缩短，提前进入指数生长期。在生态环境中，这种加速生长的响应对于生活在复杂群落（如土壤）中的微生物种群具有重要意义，它可能有助于微生物在竞争环境中更好地生存和繁衍，减少复苏过程的随机性，使种群增长更加稳定。
4. Rpf 在群落背景下的作用：土壤中大多数微生物生长缓慢或代谢不活跃，Rpf 可能在激活休眠细胞方面发挥重要作用。虽然 Rpf 主要由放线菌门细菌产生，但其作用底物肽聚糖广泛存在于几乎所有细菌的细胞壁中，理论上多种休眠细菌都可能被 Rpf 复苏。不同分类群的细菌对 Rpf 的响应存在差异，这与菌株的进化历史、细胞包膜结构以及其他功能性状有关。例如，革兰氏阴性菌对 Rpf 的某些生长参数影响更为敏感，这可能暗示除了酶与底物的直接接触外，还有其他机制参与了 Rpf 对休眠细菌的复苏过程。此外，细菌的水分生态位和生物膜产生等功能性状也与对 Rpf 的响应相关，干适应菌株对 Rpf 的响应较弱，而湿适应菌株则较强，生物膜产生与 Rpf 对滞后期的影响呈正相关，这可能反映了细菌在复苏过程中的某种权衡或酶活性在胞外聚合物基质中的差异。未来可以通过研究土壤宏基因组中 rpf 基因的分布和多样性，进一步验证这些关系，并结合环境变量开发生态位模型，以更好地预测微生物休眠策略在不同环境中的分布和作用，推动微生物休眠的宏观生态框架发展。虽然 Rpf 是调节细菌休眠的重要机制，但微生物种子库动态还受其他因素影响，如芽孢形成和持留菌形成等，这些过程共同塑造了微生物种子库的结构和功能，影响物种间的相互作用和生态系统的稳定性。

材料和方法

1. 菌株和培养：本研究使用从农业土壤中分离的放线菌菌株 Micrococcus KBS0714，其 16S rRNA 基因与研究 Rpf 的模式生物藤黄微球菌 NCTC 2662 具有 99% 的序列相似性。在常规培养中，将该菌株在 R2A 肉汤中，于 25°C、150rpm 的摇床上培养。通过让细胞进入稳定期，然后在摇床上继续培养 30 天，再静置培养 60 天，诱导细菌进入休眠状态。在进行复苏实验前，用磷酸盐缓冲液（PBS，pH = 7.0）洗涤细胞 5 次，以去除残留培养基。
2. 重组蛋白表达：提取 Micrococcus KBS0714 的基因组 DNA，通过 PCR 扩增 rpf 基因的开放阅读框，使用带有 EcoRI 限制性酶切位点（NdeI 和 BamHI）的引物进行扩增。PCR 产物经凝胶电泳和 Sanger 测序验证后，进行 NdeI/BamHI 双酶切，并连接到带有 N 端多组氨酸标签的 pET15b 表达载体上，构建重组表达质粒 pET15B-His6-rpf。将该质粒转化到大肠杆菌 Origami BL21 (DE3) 表达宿主中，通过添加异丙基 -β-D-1 - 硫代半乳糖苷（IPTG，终浓度 0.1mM）诱导 Rpf 的表达。通过超声破碎细胞、离心和过滤后，使用 Ni-NTA 纯化柱对重组 Rpf 蛋白进行纯化，并通过 SDS-PAGE 和 Western blotting 验证蛋白的表达和纯度，使用 Bradford 法测定蛋白浓度。
3. 酶动力学：利用 EnzChek 溶菌酶检测试剂盒测定重组 Rpf 的酶活性。该试剂盒使用经荧光素广泛标记的 Micrococcus lysodeikticus 细胞壁作为底物，Rpf 水解 β-(1,4) 糖苷键后会产生荧光信号，其强度与溶菌酶活性成正比。将 Rpf（1mg/mL，34μM）与不同浓度（0 - 30μg/L）的底物在 22°C 孵育 24 小时，同时设置 90°C 孵育 1 小时的热失活酶作为对照。使用 BioTek Synergy H1 酶标仪，在激发 / 发射波长为 485/530nm 处测量荧光强度，并通过最大似然法拟合 Michaelis-Menten 函数来量化酶动力学参数。
4. Rpf 浓度依赖性：将处于稳定期末期的 Micrococcus KBS0714 休眠细胞用 PBS 洗涤 5 次后，接种到含有不同浓度（0 - 6μM）重组 Rpf 的 48 孔平底培养板中，每孔加入 1mL R2A 肉汤。在 25°C、150rpm 条件下孵育 120 小时后，通过测定光密度（OD₆₀₀）来估计生物量，并将所得数据拟合到 Monod 生长方程中，以研究 Rpf 浓度对细菌生长的影响。
5. 种群动态：将长期处于稳定期（90 天）的 Micrococcus KBS0714 休眠细菌用 PBS 洗涤 5 次后，接种到含有 35mL 乳酸盐基本培养基（含 1% L - 乳酸锂）的 250mL 侧臂烧瓶中。分别添加重组 Rpf（终浓度 0.5μM）或蛋白缓冲液作为对照，每组设置 4 个重复。在 25°C、150rpm 的摇床上培养，定期使用 Biophotometer（Eppendorf）测定生物量（OD₆₀₀）。通过最大似然法将所得数据拟合到修正的 Gompertz 方程中，计算最大生长速率（μmax）、滞后期（λ）、生物量产量（A）等生长参数，并使用 t 检验分析 Rpf 处理对这些参数的影响，同时使用 F 检验评估 Rpf 处理是否改变生长曲线参数的方差齐性。
6. Rpf 突变：使用 QuikChange 定点突变试剂盒对 Micrococcus KBS0714 的 rpf 基因中保守的谷氨酸残基（E54）进行突变，按照试剂盒说明进行操作，包括引物设计、PCR 反应、甲基化处理和转化等步骤。通过 Sanger 测序验证突变的成功。此外，设计引物通过 PCR 扩增删除 Rpf 基因中可变连接区和 LysM 结构域，构建截断突变体，表达并纯化重组蛋白。将休眠细胞用 PBS 洗涤 5 次后，在含有 2.5μM Rpf（野生型或突变型）的 R2A 肉汤中，于 25°C、150rpm 条件下孵育 72 - 360 小时，使用 Biophotometer（Eppendorf）测定终点生物量（OD₆₀₀