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为探究蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）对环丙沙星耐药的基因型变化，研究人员开展了环丙沙星耐药菌株的实验进化研究。通过 20 轮环丙沙星暴露实验，对 95 株进化菌株进行基因组测序。结果发现许多新突变，这为研究耐药机制提供重要数据。
蜡样芽孢杆菌（
Bacillus cereus）是一种能形成芽孢、杆状的革兰氏阳性菌，在人体内可共生也可致病。其感染常与食源性疾病相关，还能引发眼、肺和中枢神经系统的严重感染。由于该菌对 β - 内酰胺类抗生素天然耐药，环丙沙星或万古霉素常被用于治疗感染。然而，抗生素耐药性的出现不可避免，研究耐药进化机制对监测、预测和缓解未来潜在疫情至关重要。
为了阐明与环丙沙星耐药相关的基因型变化，研究人员对蜡样芽孢杆菌的环丙沙星耐药菌株进行了实验进化。以敏感的亲本菌株 ATCC 14579 为研究对象，在阳离子调整的 Mueller Hinton 肉汤（CAMHB）中进行 20 轮环丙沙星暴露实验。实验在 96 孔板中进行，环丙沙星浓度范围为 0.0625 - 32 μg/mL。将孔板盖上盖子，在 37°C 的湿润培养箱中孵育 22 - 24 小时。24 小时后，检查孔内细菌生长情况并记录最低抑菌浓度（MIC）的众数。之后，每轮选择 0.5×MIC 的培养物进行再次暴露。每个选择周期后，通过平板培养从培养物中分离单菌落，并按照临床和实验室标准协会（CLSI）M0 - A10 协议，采用微量稀释法测定 MIC。对得到的突变体进行基因组测序。
在 DNA 制备过程中，从甘油冻存管中复苏菌株，在 Mueller Hinton 琼脂平板上划线培养，37°C 过夜。挑取单菌落接种到 50 mL Mueller Hinton 肉汤中，37°C、180 rpm 振荡培养过夜。将培养物离心，收集沉淀用于 DNA 提取，使用 Qiacube 的 “QIAamp Mini 细菌或酵母 DNA 酶解裂解 V1 方案”。酶解裂解在 180 μL Tris - EDTA（50 mM Tris - Cl pH 8，1 mM EDTA）（TE）缓冲液、1.2% Triton 和 20 mg/mL 溶菌酶中进行。
测序文库制备无需片段剪切或大小筛选，分别使用牛津纳米孔原生条形码测序试剂盒（SQK - NDB114）和 Illumina Nextera XT 试剂盒，并在 GridION vR10.4.1 和 Illumina MiSeq（2×151 - bp v2 试剂盒）仪器上进行测序。纳米孔数据的碱基识别、解复用和接头修剪使用 Dorado v0.5.2 软件，采用超高精度模型。使用 FiltLong 0.2.1 软件进行额外的质量控制（QC）过滤。Illumina MiSeq 数据使用其自带的质量过滤器进行 QC，并使用 fastp v0.23.2 软件去除接头序列。所有数据使用 Flye v2.9 软件进行组装，利用 Medaka 软件对长读长数据进行一轮抛光，再用 Polypolish v0.5.0 和 Pypolca v2.1.0 软件进一步优化。质粒使用 Plassembler v1.62 软件进行组装。使用 Prokka v1.14.5 软件对混合基因组进行注释，纳米孔数据使用 Minimap2 软件进行参考比对（长读长数据使用 - ax 参数），Illumina 数据使用 BWA 软件进行参考比对。除 Minimap2 软件外，其他软件均使用默认参数。使用 CheckM v1.1.6 和 CheckM v2 v1.0.2 软件评估，结果显示所有基因组完整性大于 99%，污染率小于 3%。
