旁观者编辑效应阻碍腺嘌呤碱基编辑器在Leber先天性黑蒙症小鼠模型中的视觉功能恢复

本研究揭示了腺嘌呤碱基编辑器（ABE）在治疗遗传性视网膜疾病时面临的重大挑战。通过Leber先天性黑蒙症（LCA）小鼠模型，研究者发现高活性ABE8e版本产生的旁观者编辑（bystander editing）会导致RPE65蛋白关键结构域（42LLRC45和527HGLF530）构象改变，尽管能恢复RPE65表达，却无法实现视觉功能重建。研究结合AlphaFold结构预测和分子动力学（MD）模拟，证实L43P突变通过破坏β-折叠相互作用导致蛋白功能缺陷，为基因编辑工具的精准优化提供了重要依据。

　　碱基编辑技术的治疗困境与突破
研究背景
CRISPR-Cas系统作为基因编辑利器，其衍生工具碱基编辑器（BEs）能实现精准的单碱基替换而不产生DNA双链断裂（DSBs）。腺嘌呤碱基编辑器（ABE）可将A•T碱基对转换为G•C，在遗传病治疗中展现出巨大潜力。然而，旁观者编辑（bystander editing）——即在编辑窗口内非目标碱基的意外修饰，成为制约临床应用的关键瓶颈。

实验设计与发现
研究团队选用Leber先天性黑蒙症（LCA）小鼠模型（rd12），该模型携带Rpe65基因c.130C>T无义突变。通过比较三种NG-Cas9基ABE变体（ABEmax、ABE8e和ABE8eWQ）的编辑特性发现：
• ABE8e编辑效率最高（目标位点A6编辑率16.38%），但产生广泛旁观者编辑（A3 12.32%、C5 3.12%、A8 14.77%、A11 5.49%）
• ABEmax和ABE8eWQ旁观者编辑主要限于A8位点（4.61%和2.76%）
• 免疫荧光显示三组RPE65阳性细胞比例相当（约50%），但仅ABEmax和ABE8eWQ组实现视觉功能恢复

分子机制解析
通过AlphaFold预测和100ns分子动力学模拟揭示：
• L43P突变导致⁵²⁷HGLF⁵³⁰结构域β-折叠解离，破坏与⁴²LLRC⁴⁵的疏水相互作用
• 突变体结构水合作用增强（水分子数增加35%），提示局部构象不稳定性
• 双突变体L42P/L43P引起更严重的结构重排

临床转化意义
该研究首次在动物模型中证实：

1. 旁观者编辑产生的错义突变（如L43P）可抵消治疗效益
2. 蛋白结构预测工具（AlphaFold）能有效评估编辑风险
3. 需平衡编辑效率与特异性，ABE8eWQ展现出更优的治疗窗口

技术展望
研究建议未来发展方向包括：
• 开发更窄编辑窗口的BE变体
• 采用非病毒递送降低旁观者效应
• 结合结构预测预判突变影响
该成果为遗传性视网膜疾病的精准基因治疗提供了重要范式，也为其他单基因疾病的碱基编辑治疗策略敲响警钟。