综述：共轭刺激干扰素基因蛋白（STING）激动剂

这篇综述聚焦刺激干扰素基因蛋白（STING）激动剂，阐述其在癌症免疫治疗中的研究进展。天然 STING 激动剂环二核苷酸（CDNs）存在缺陷，非 CDN STING 激动剂不断涌现。文中详细介绍了多种类型的激动剂、共轭策略，还探讨了临床试验情况及未来发展方向。

　　

一、引言

细胞的先天免疫系统在保护宿主免受病原体感染方面至关重要。细胞进化出多种模式识别受体（PRRs）来快速检测病原体。2013 年发现的环磷酸鸟苷 - 腺苷一磷酸（cGAMP）合酶（cGAS）是重要的细胞质 DNA 传感器。当检测到病原体或自身细胞质中的 DNA 时，cGAS 可催化生成 2′,5′ - 3′,5′ - 环磷酸鸟苷 - 腺苷一磷酸（2′3′ - cGAMP），2′3′ - cGAMP 进而结合并激活干扰素基因刺激蛋白（STING），引发先天免疫信号级联反应，包括释放 I 型干扰素和其他细胞因子。

环二核苷酸（CDNs）作为天然的 STING 激动剂，在癌症免疫治疗的药物开发中面临诸多挑战，如高极性、血浆半衰期短、细胞靶向性和膜通透性差等。为克服这些问题，研究人员致力于 CDNs 的结构修饰、非 CDN STING 激动剂的开发以及通过共轭或脂质体 / 纳米颗粒递送 STING 激动剂。本文重点介绍非 CDN STING 激动剂及其共轭递送策略，以及它们在临床试验中的应用和面临的挑战。

二、PRRs

先天免疫系统利用具有固定特异性的受体识别微生物的保守特征，这些受体被称为种系编码的 PRRs。PRRs 可识别多种微生物特征，其中核酸是个例外，虽然病原体和宿主都含有核酸，但先天免疫系统仍能通过多种识别核酸的 PRRs 检测微生物，例如检测病毒主要依赖识别病毒核酸。

脊椎动物的大多数 PRRs 分为 Toll 样受体（TLRs）、核苷酸寡聚化结构域样受体、视黄酸诱导基因 I（RIG - I）样受体、C 型凝集素受体、黑色素瘤缺失 2（AIM2）样受体和 cGAS 等类别。识别核酸的 PRRs 根据核酸在细胞中的定位不同可分为两类，TLR 家族（如 TLR3、TLR7 和 TLR9）监测内溶酶体中的双链 RNA（dsRNA）和单链 RNA；病原体核酸进入细胞质后，则由细胞质受体监测，如 RIG - I 识别短 dsRNA 和 5′ - 三磷酸化 RNA，黑色素瘤分化相关蛋白 5 识别长 dsRNA。

尽管有多种细胞质受体，但细胞质 DNA（无论是非自身还是自身的）被 PRRs 识别后，大多通过诱导释放 I 型干扰素等活性因子来激活先天免疫系统。不过，这些 PRRs 并非通用，具有细胞类型或 DNA 序列特异性。

三、cGAS 和 STING

cGAS 是细胞质 DNA、HIV 和其他逆转录病毒的先天免疫传感器。cGAS 的激活与 DNA 长度密切相关，小于 20bp 的 DNA 配体虽能与 cGAS 结合形成 2:2 复合物，但因复合物不稳定无法激活 cGAS；大于 20bp 的较长 DNA 可被识别形成稳定的 cGAS_2n - DNA₂阶梯（n≥2），强烈激活 cGAS。cGAS 与 DNA 配体结合后会重新组装成激活构象，催化 ATP 和 GTP 合成 cGAMP，即 2′,3′ - cGAMP。

2′,3′ - cGAMP 激活 STING 后，复合物从内质网转移到高尔基体，激活 TANK 结合激酶 1（TBK1），促进干扰素调节因子 3（IRF3）的磷酸化和二聚化，还可能激活 IκB 激酶促进核因子 κB（NF - κB）的磷酸化。磷酸化的 IRF3 和 NF - κB 进入细胞核，诱导干扰素、炎症细胞因子和趋化因子的表达，这些因子在免疫刺激中发挥重要作用，可促进 T 细胞、树突状细胞（DCs）和自然杀伤细胞的启动和激活，最终引发免疫反应。

STING 是一种主要位于内质网的小分子量（二聚体约 80kDa）膜蛋白，由短的 N 端胞质段、四个跨膜螺旋、胞质配体结合域（LBD）和负责结合 TBK1 的 C 端尾部组成。LBD 可识别双链 DNA 和第二信使 CDNs，包括环二鸟苷酸单磷酸（c - di - GMP）、环二腺苷酸单磷酸（c - di - AMP）、3′,3′ - 环磷酸鸟苷 - 腺苷一磷酸（3′,3′ - cGAMP）、3′,2′ - 环磷酸鸟苷 - 腺苷一磷酸（3′,2′ - cGAMP）和 2′,3′ - cGAMP。人类 STING 具有多态性，主要有 R232（58%，通常称为野生型）、HAQ（20%）、H232（13%）、AQ（7%）和 Q（2%）五种变体，其中内源性 2′,3′ - cGAMP 与人类 STING 的结合亲和力高于其他 CDNs。

四、天然 CDN STING 激动剂

目前已报道了五种天然 CDNs，分别是 c - di - GMP、c - di - AMP、3′,3′ - cGAMP、2′,3′ - cGAMP 和 3′,2′ - cGAMP。

• c - di - GMP：c - di - GMP 是细菌中普遍存在的第二信使分子，参与调节细菌的多种生理功能，如细菌通讯、细胞分化、生物膜形成和细胞形态变化等。1987 年被发现，通常由含 GGDEF 结构域的蛋白质合成，含 EAL 结构域的磷酸二酯酶（PDEs）可降解它。目前已发现多种 c - di - GMP 受体蛋白，包括 PilZ 结构域蛋白、含 GGDEF 或 EAL 结构域的蛋白以及核糖开关等。
• c - di - AMP：2008 年被发现，在研究 DNA 损伤检查点激活机制时被首次鉴定。它由双腺苷酸环化酶合成，可被含 GGDEF 结构域蛋白中的 PDEs 降解为线性 pApA 结构。2013 年确认了其受体蛋白 Ms5346，还发现了其他保守受体蛋白，如钾转运体门控组件 KtrA 和阳离子 / 质子反向转运体 CpaA，它们都含有 RCK_C（K⁺电导调节）结构域，是结合 c - di - AMP 的关键位点。
• 3′,3′ - cGAMP：2012 年在研究霍乱弧菌致病机制时被发现，由毒素共调节菌毛（TCP）岛上编码的新型二核苷酸环化酶（DncV）合成。2015 年报道了能特异性降解 3′,3′ - cGAMP 的三种 PDEs（V - cGAP1/2/3），还发现了能结合 3′,3′ - cGAMP 的突变型核糖开关以及可合成 3′,3′ - cGAMP 的细菌Geobacter metalloreductus。
• 2′,3′ - cGAMP：2013 年在研究细胞质 DNA 诱导干扰素释放机制时被发现，由 cGAS 催化 ATP 和 GTP 合成，可激活 IRF3 诱导 IFN - β 释放。2014 年发现 ecto 核苷酸焦磷酸酶 / 磷酸二酯酶（ENPP1）可将 2′,3′ - cGAMP 降解为 ATP 和 GTP。
• 3′,2′ - cGAMP：在模式生物Drosophila melanogaster中被鉴定，由 cGAS 样受体（cGLRs）之一的Dm - cGLR1 识别 dsRNA 后合成。Drosophila STING 对 3′,2′ - cGAMP 的亲和力高于 2′,3′ - cGAMP，3′,2′ - cGAMP 还具有抗切割特性，可使果蝇抵御病毒免疫逃逸。它可由 CdnG 激活合成，能激活Asticcacaulis sp. Cap5 和Lactococcus lactis Cap5 进行 DNA 降解。在哺乳动物中，3′,2′ - cGAMP 信号通路优先诱导许多与转录、核小体定位和组装相关的 STING 依赖性基因。

五、非 CDN STING 激动剂

天然 STING 激动剂 CDNs 存在细胞膜通透性差和在某些 PDEs 作用下不稳定等缺陷，限制了其治疗应用。因此，新型非 CDN STING 激动剂不断涌现。

• 早期的非 CDN STING 激动剂：在 2′,3′ - cGAMP 发现之前，已报道了一些非 CDN STING 激动剂，如 5,6 - 二甲基呫吨酮 - 4 - 乙酸（DMXAA）、黄酮乙酸（FAA）和 10 - 羧甲基 - 9 - 吖啶酮（CMA）。但这些激动剂在临床试验中均失败，原因是它们与人类 STING 的结合亲和力不足，只能刺激小鼠 STING，无法诱导人类细胞的免疫反应。
• 新型非 CDN STING 激动剂
  • Dispiro diketopiperzine、BNBC 和 C11：2017 年通过基于 HepAD38 衍生的报告细胞系的高通量筛选（HTS）发现了第一种非 CDN 人类 STING 激动剂 Dispiro diketopiperzine（DSDP），它能诱导人类皮肤成纤维细胞和外周血单核细胞中 STING 依赖性的 IFN - 主导细胞因子反应。2019 年又报道了另一种 STING 激动剂 6 - 溴 - N -（萘 - 1 - 基）苯并 [d][1,3] 二恶唑 - 5 - 甲酰胺（BNBC），它只能激活人类 STING，可诱导细胞因子释放并促进 DC 成熟。2018 年通过 HTS 从约 52,000 个分子中筛选出N -（甲基氨基甲酰） - 2 - [5 -（4 - 甲基苯基） - 1,3,4 - 恶二唑 - 2 - 基] 硫烷基 - 2 - 苯基乙酰胺（C11），它能诱导人类成纤维细胞和髓系来源的 MM6 细胞产生抗病毒 I 型干扰素，但对小鼠细胞无此作用。
  • α - Mangostin：α - Mangostin 是从山竹中分离出的一种膳食呫吨酮，具有抗肿瘤和抗病毒活性。因其与 DMXAA 具有相同的呫吨酮骨架，被确定为人类 STING 激动剂，对小鼠 STING 也有较弱的激动作用。
  • Amidobenzimidazole：2018 年葛兰素史克公司通过基于竞争性结合³H - cGAMP 靶向人类 STING 的 HTS 平台，开发出第一种全面的非 CDN STING 激动剂 amidobenzimidazole（ABZI）。受 ABZI 与 STING 共晶体结构的启发，形成的二聚体化合物 diABZI 与人类 STING 的结合亲和力大幅提高，能诱导剂量依赖性的 IFN - β 分泌，静脉注射可在小鼠中产生持久的抗肿瘤效果。
  • SR - 717 和 MSA - 2：2020 年，斯克里普斯研究所和默克公司分别报道了 SR - 717 和 MSA - 2 这两种新型非 CDN STING 激动剂。它们可通过 THP - 1 细胞为基础的 HTS 筛选得到，能像 2′,3′ - cGAMP 一样直接与 STING 的闭合构象结合。SR - 717 可诱导轻度体内抗肿瘤活性，MSA - 2 是口服可用的人类 STING 激动剂，在多种给药方式下都能刺激肿瘤内 IFN - β 分泌，导致肿瘤消退，并能与抗程序性细胞死亡配体 1（PD - L1）疗法产生协同效应。
  • G10 系列：2015 年开发的化合物 G10 在 THP - 1 细胞中无法激活 IRF3 或 NF - κB 相关报告基因，但能激活永生化人类成纤维细胞中的 IRF3 和 IRF3 依赖性转录活性。2020 年研究发现 G10 激活 IRF3 具有变体依赖性，对 R232 和 H232 变体更有效。之后还发现了能激活所有五种主要 STING 变体的化合物 53（C53），它结合在 STING 跨膜结构域（TMD）的一个隐蔽位点，与 2′,3′ - cGAMP 协同促进 STING 高阶寡聚体的形成，增强 STING 的激活。
  • NVS - STGs：诺华公司基于 THP - 1 - Dual 细胞从包含 250,0000 种化合物的化学库中开发出 NVS - STGs 系列非 CDN STING 激动剂。研究表明，这些激动剂不与 STING 的 LBD 结合，而是与 TMD 结合，作为分子胶促进 STING 寡聚化，为 STING 激动剂提供了新的结合位点。
  • 其他激动剂：通过细胞基于 IRF/IFN 途径报告基因检测获得的 Ziyuglycoside II（ST12），能增强 THP - 1 细胞中 NF - κB 的表达，但与人类 STING 的结合亲和力较弱。采用化学型杂交方法筛选出的 pyrazolopyrimidine acid，可诱导人类细胞报告试验中的微摩尔级 NF - κB 和 IRF 活性。通过表面等离子共振筛选 FDA 批准药物库发现的 M335，能激活 STING - TBK1 - IRF3 通路，抑制多种难治性冷肿瘤的生长。从已知抗肿瘤药物中鉴定出的 KAS - 08，是一种有效的非 CDN STING 激动剂，在体内外都有活性。

六、共轭 STING 激动剂

将 STING 激动剂与其他化学 / 生物功能部分（如小分子、功能基团甚至抗体）共轭，主要是为了解决其被 ENPP1 和 poxin 降解、细胞摄取受限、循环半衰期短等问题，实现持续的 STING 激活和最佳的抗肿瘤疗效，以及引入化学基团带来的协同效应。同时，脂质 / 纳米颗粒（NPs）/ 聚合物与 STING 激动剂的直接共轭也被广泛研究。

• 化学修饰
  • CDNs 的化学修饰：CDNs 的常见化学修饰包括核碱基替换、核糖取代、磷酸修饰以及核苷酸间连接位置的改变。例如，合成的含额外核碱基的 3′,3′ - 环腺苷 - 胞苷单磷酸（3′,3′ - cACMP）显示出较弱的 I 型干扰素反应；设计的多种新型环腺苷 - 肌苷单磷酸（cAIMP）类似物中，3′,3′ - cAIMP 在诱导人类血液离体 I 型干扰素方面表现出色，进一步修饰可降低其 EC₅₀值。对于核糖部分，不同修饰对 CDNs 的酶稳定性和结合亲和力有不同影响；磷酸部分的硫代磷酸修饰可提高脂溶性、酶抗性和生物活性，且R构型的硫代磷酸非对映异构体活性更强。
  • 非 CDN STING 激动剂的结构优化：对非 CDN STING 激动剂（如 ABZI 类型）进行结构活性关系（SAR）研究和结构优化，可得到更有效的 STING 激活剂，如 CF501、thieno [2,3 - d] imidazole 衍生物、tricyclic scaffold HB3089 和 SHR1032 等，但部分激活剂的激活效果相对较弱。
• 共轭策略
  • 与小分子化学基团共轭：为克服 STING 激动剂的稳定性和跨膜效率问题，与小分子化学基团共轭是常用策略。例如，将硫和氟取代的 c - di - GMP（CDG^SF）与 TLR1/2 激动剂共轭形成的 Pam₃CSK₄ - CDG^SF，可协同激活 STING 和 TLR 通路，显著抑制肿瘤生长。对 3′,3′ - c - di - AMP 进行烷基化修饰，可提高其细胞摄取和活性，如 DTE - 3′,3′ - c - di - AMP、bis（POC） - 3′,3′ - c - di（2′ - fluoro - 2′ - deoxy - AMP）和 SATE - 3′,3′ - c - di - dAMP 等共轭物都表现出良好的细胞摄取和抗肿瘤效果。将顺铂与 STING 激动剂 MSA - 2 共轭形成的 Pt^IV - MSA - 2 共轭物，具有独特的抗癌机制，能有效抑制肿瘤生长。
  • 与脂质 / NPs / 聚合物共轭：将修饰后的 CDN 与硫醇终止的聚乙二醇 - 磷脂（PEGylated lipids）共轭并自组装成纳米颗粒（NPs），如 LND - CDN，可提高 CDN 的稳定性和抗肿瘤疗效。将 CDN 与聚（β - 氨基酯）NPs 共轭，如 ML - 347 与聚（β - 氨基酯）NPs 共轭形成的 CDN - NPs，可稳定存在于小鼠血浆中，有效激活免疫细胞，与抗 PD - 1 联合使用可扩大治疗窗口。将 STING 激动剂 MSA - 2 与声动力半导体聚合物核共轭，如 SPNM - MSA - 2，在声照射