基于连接酶引发等温扩增的尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（UDG）活性荧光检测策略：助力早期疾病诊断新突破

为解决现有尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（UDG）检测方法的不足，来自中国的研究人员开展了基于连接酶引发等温扩增检测 UDG 活性的研究。结果显示该方法能快速检测 UDG，UDG 浓度超 0.5 U/mL 可完全抑制荧光。这对早期疾病诊断有重要意义。

　　尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（Uracil-DNA glycosylase，UDG）在碱基修复系统中起着关键作用，检测其酶活性对于早期疾病诊断至关重要。研究人员开发了一种快速检测 UDG 的方法，利用连接反应引发的扩增。用含尿嘧啶修饰的 DNA 探针将两条游离的 DNA 链连接形成新的 DNA 链，这会触发切口酶辅助的扩增反应，产生单链 DNA（ssDNA）。随后，扩增的 ssDNA 触发分子信标发出荧光。然而，加入 UDG 会使 DNA 探针链上的尿嘧啶被去除，留下无碱基位点（AP 位点）。经过热变性，该位点被破坏，阻止后续的连接或扩增反应，导致无荧光产生。研究结果表明，当加入浓度超过 0.5 U/mL 的 UDG 时，荧光强度会被完全抑制，降至 0。相反，在没有 UDG 酶，或加入其他酶和蛋白质（如 hAAG、EndoIV 和 BSA）时，系统的荧光强度不受影响，在 5 - 20 分钟内可达到 100% 的强度。本研究提出了一种快速评估 UDG 活性的方法，未来可能对早期疾病诊断具有重要价值。DNA 的结构可能会被活性氧物种和辐射等因素破坏，导致基因组结构不稳定，进而引发疾病。胞嘧啶脱氨是最常见的 DNA 损伤形式，会使胞嘧啶转变为尿嘧啶，导致 U:G 错配。若不纠正，在 DNA 复制过程中可能会导致 G:C 到 T:A 的突变。这些突变可整合到信使 RNA 中，改变编码的蛋白质。UDG 通过激活碱基切除修复，切割脱氧核苷酸中尿嘧啶与戊糖之间的 N - 糖苷键，产生一个 AP 位点。随后，核酸内切酶 IV 的切割可从双链 DNA 中去除并纠正 AP 位点。当体内 UDG 活性异常时，基因组的完整性会受到损害，可能导致癌症、免疫缺陷疾病和某些遗传疾病的发生。因此，高灵敏度检测 UDG 活性在早期临床检测中具有重要意义。UDG 的检测方法包括质谱法、凝胶电泳法和放射性标记法等，但这些技术存在操作复杂、样本要求严格和使用有害物质等缺点。为克服这些缺点，研究人员开发了其他方法，如电化学、化学发光和荧光检测法。这些方法通常利用 UDG 消除含尿嘧啶的 DNA 底物，降低其杂交稳定性并改变其构象。然而，诱导这种构象和稳定性变化所需的 UDG 量相对较大，导致灵敏度降低。为提高检测灵敏度，研究人员利用了核酸扩增技术，如连接酶链式反应（LCR）、滚环扩增（RCA）或链置换扩增（SDA）技术。这些检测 UDG 的技术基本原理是设计一条含 dU 的 DNA 链。加入 UDG 后，尿嘧啶会从 DNA 链上被去除，留下 AP 位点。核酸内切酶 IV 会在该位点切割，形成含有游离 3'^OH的引物，产生的单链 DNA（ssDNA）会引发核酸扩增。然后，扩增产物可用染料、分子信标或基于 G - 四链体（G4）的化学发光或荧光检测法进行分析。然而，RCA 需要设计更长的标记 DNA 链。等温 DNA 扩增技术引入了切口内切酶和嗜热 DNA 聚合酶，可能会引发非特异性扩增，限制了这些方法的应用。在本研究中，用含尿嘧啶序列的 DNA 探针将两条游离的 DNA 链连接成完整的链，触发由切口内切酶和 DNA 聚合酶介导的扩增反应。扩增反应产生的单链 DNA 可设计用于打开分子信标，产生强荧光。或者，扩增的单链 DNA 形成 G4 结构，由于 G4 与硫黄素 T（ThT）的特异性结合而发出强荧光，该特性也可用于检测本研究中的扩增产物。然而，加入 UDG 会导致连接两条游离 DNA 链的含尿嘧啶 DNA 探针中的尿嘧啶水解，在高温变性时导致探针断裂，使其无法进行连接和扩增反应，系统不会产生荧光。虽然本方案中引入了切口内切酶，但与未加 UDG 的相同反应相比，荧光减弱，因此，切口内切酶引起的非特异性背景对 UDG 的检测没有影响。人类细胞含有许多 G4 结构，因此，利用 G4 与 ThT 结合后的荧光增强来评估 UDG 活性可能会导致假阳性结果。本方案的原理是加入 UDG 后 G4 的扩增减少，并且利用 G4 与 ThT 的结合产物来独立于体内 G4 结构直接检测真核细胞中的 UDG 活性。实验材料和试剂方面，尿嘧啶 - DNA 糖基化酶（UDG，1 个单位的 UDG 定义为在 37°C 下 1 小时内从含尿嘧啶的 DNA 中催化释放 1 nmol 尿嘧啶所需的酶量）和 dNTP 混合物（10 mM）购自中国上海的生工生物工程股份有限公司。Taq DNA 连接酶、Bst 2.0 DNA 聚合酶、WarmStart? Nt.BstNBI、烷基腺嘌呤糖基化酶（hAAG）购自中国北京的 New England Biolabs 公司。裂解缓冲液（RIPA）购自碧云天生物技术有限公司。UDG 检测方法的设计原理是，该检测方法需要设计一个在中间区域含有两个脱氧尿苷（dU）残基的 DNA 探针（Probe - dU）序列，以及另外三个 DNA 序列 P1、P2 和 P3。为了将 P1 和 P2 连接成完整的单链，探针序列与 P1 的 5' 区域和 P2 的 3' 区域互补，且 P1 的 5' 端被磷酸化。P2 的 5' 末端区域设计为模拟 WarmStart? Nt.BstNBI 切口位点的 27 个核苷酸序列。P3 作为引物。等温扩增技术因其方便、简单且能够增强信号放大，常被用于小分子、蛋白质和酶的检测。切口内切酶常用于等温扩增，其加入显著提高了扩增速率。然而，这个过程常伴随着非特异性产物的产生，表现为酶与 DNA 聚合酶之间的相互作用。总之，本研究通过连接引发的等温扩增反应建立了一种快速、特异性检测 UDG 活性的方法。当不添加 UDG 时，反应会进行连接，进而引发后续的扩增；而当向系统中添加 UDG 时，DNA 探针中的尿嘧啶被去除，导致连接失败，无法进行扩增。实验结果表明，这个新系统能够简单快速地检测 UDG，具有一定优势。本文的作者贡献声明为：张潘松负责概念构思、数据整理、资金获取、项目管理、软件、监督、验证、撰写初稿（同等贡献）；何芳芳负责形式分析、调查、方法学；常欣负责项目管理、软件、监督；任晨霞负责概念构思、数据整理、资金获取。作者声明他们没有已知的可能影响本文所报告工作的竞争性财务利益或个人关系。本研究得到了山西省基础研究计划（项目编号：202203021222314）和山西省基础研究计划（项目编号：202403021212062）的资助。