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本文是关于非模式和新兴模式生物基因组测序与组装的综述。详细介绍了基因组项目各阶段操作，如前期决策、DNA 提取、测序等，对比多种技术方法，阐述质量评估与注释要点，为相关研究提供全面指导，助力基因组学深入探索。
基因组测序与组装的重要意义
基因组学研究基因序列及其在种群和物种间的差异，对生物学、医学和农业等领域影响深远。参考基因组序列是研究基因功能、物种进化和生物多样性的关键基础。人类基因组计划（HGP）开启了基因组研究新纪元，之后高通量测序技术推动了基因组学快速发展，使大规模比较基因组学研究成为可能。如今，长读长测序技术的应用让高质量基因组组装成为现实，这有助于科学家揭示更多遗传信息，推动生物学各领域发展。
基因组项目的研究问题与测序策略
不同的基因组分析问题需要不同的测序策略。低至中等覆盖度（5× - 20×）的短读长测序适用于已有参考基因组的种群基因组学研究，可用于检测选择压力下的基因和单核苷酸多态性（SNP）等。但对于构建新的参考基因组，纯短读长数据并不理想，不过在某些特殊情况下，如样本 DNA 质量差或资源有限时，短读长组装仍能提供有用信息，用于种群基因组学中的 SNP 比较、核标记分析和引物设计等。染色体水平的基因组项目常用长读长测序，结合 Hi-C 等辅助信息构建支架，虽可能存在部分未确定序列，但能支持比较基因组学研究，分析基因组结构、选择和基因家族进化，以及探究基因组大小变化的原因。而端粒到端粒（T2T）的高质量基因组组装可揭示基因组进化的隐藏结构动态，但目前仍面临着端粒、着丝粒和性染色体等区域测序的挑战。
基因组项目的步骤
- 项目启动前的决策（phase 1）
- 数据挖掘：在启动基因组项目前，需全面搜索公共数据库和相关基因组计划，了解已有的基因组数据和正在进行的项目，避免重复研究。Genomes on a tree hub 等平台可提供全面的基因组项目信息。
- 确定基因组大小和倍性水平：准确估计基因组大小对计算测序数据量至关重要，可通过序列无关方法（如流式细胞术）或基于测序数据的生物信息学方法（如 k-mer 分析）进行测量。此外，了解物种的倍性水平也很重要，因为它会影响基因组的组装和注释，可通过核型分析确定，但该方法较为繁琐，新研究项目可能难以在测序前获取相关信息。
- 确定预期的基因组质量和测序方法：根据研究目的和预算确定预期的基因组组装质量，如低覆盖度、染色体水平或 T2T 水平。长读长测序是现代基因组测序的核心，PacBio 和牛津纳米孔（ONT）各有优劣，二者结合可能获得更好的组装效果。若研究需要分离染色体单倍型（phasing），可采用长读长和 Hi-C 数据结合的方法，或利用亲子样本的短读长数据辅助。
- 样本选择：为减少遗传变异，通常优先选择单个个体进行基因组测序。若必须使用多个个体，应尽量减少生物差异，如选择克隆、同一品系或同一野生种群的个体。选择组织时，应避免肠道组织，选择含杂质少的组织，如脊椎动物的大脑、脾脏等。若要进行 phasing，可选择亲子 trio 样本，也可利用准确的长读长数据或 Hi-C 数据实现。
- 成本和生物信息学资源估算：根据基因组大小和预期覆盖度计算所需测序数据量，同时考虑数据过滤和二次测序的情况。成本因测序公司和年份而异，生物信息学资源需求主要取决于基因组大小、覆盖度和重复序列复杂度。小型基因组（200 - 300 Mb）在实验室进行长读长测序的耗材成本约为 500 - 1000 �，哺乳动物基因组（3 Gb）则约为 1000 �，但公司测序成本可能更高。基因组组装所需的计算资源，如内存和核心数，也因基因组大小而异。
- DNA 提取和全基因组扩增（phase 2）
- DNA 提取：高质量的高分子量（HMW）DNA 是长读长测序的关键，新鲜或速冻组织样本为佳。多种 DNA 提取方法可供选择，经典的酚 - 氯仿沉淀法（PCI）虽有效，但酚和氯仿具有危险性。目前有许多专门用于 HMW DNA 提取的商业试剂盒，如 MagAttract HMW DNA kit、ZYMO HMW 等，这些试剂盒可提高测序输出和组装成功率。对于 ONT 长读长测序，富集长片段可增加产量，可采用短读消除器（SRE）试剂盒、磁珠或 BluePippin 机器等方法。
- 长程 PCR / 全基因组扩增和超低输入协议：当 DNA 量有限时，可采用长程 PCR / 全基因组扩增（WGA）方法。PacBio 的 Ultra - Low Input DNA workflow 可从少量 DNA 生成高质量数据，但 PCR 扩增会减小插入片段大小，且该方法适用于基因组大小不超过 500 Mb 的物种。改良后的 PacBio Ampli - Fi kit 可处理更大基因组。多重置换扩增（MDA）是另一种常用方法，利用 phi29 DNA 聚合酶，能产生高准确性片段，但可能会产生嵌合序列。
- 测序（phase 3）
- 牛津纳米孔长读长测序：ONT 测序技术通过纳米孔检测 DNA 分子通过时的离子电流变化来确定 DNA 序列，可直接读取长片段 DNA，检测碱基修饰，但存在错误率较高的问题。ONT 文库制备通常需要进行片段大小选择，以富集长片段 DNA。不同的 ONT 流动池具有不同的测序输出，PromethION 流动池可从有限的起始材料中生成大量序列数据。ONT 有多种文库制备试剂盒，如 Rapid Sequencing Kit 适用于快速文库制备，Ligation Sequencing Kit（LSK）可获得较长读长，结合 NEB Monarch HMW DNA 提取试剂盒和 Ultralong Sequencing Kit 可优化读长性能。
- PacBio 长读长测序：PacBio 采用单分子实时（SMRT）测序技术，通过检测荧光标记核苷酸的掺入来确定 DNA 序列。传统 PacBio 测序原始读长错误率较高，Circular Consensus Sequencing（CCS）策略可提高测序准确性，产生高保真（HiFi）读长，错误率低于 0.1%。PacBio 有 HiFi Express Template Prep Kit 2.0 和 SMRTbell Prep Kit 3.0 等试剂盒，可用于标准和低 DNA 输入协议，低输入协议适用于小生物基因组测序，甚至可从极少量 DNA 制备文库。
- 通过额外长程信息改进组装：初始长读长组装的 contigs 数量通常多于染色体数量，可利用额外的序列信息进行支架构建，提高组装质量。Hi - C 技术通过交联染色质区域并测序，根据染色质相互作用模式将 contigs 排序和定向，从而实现染色体水平的组装。光学映射是另一种支架构建方法，但因技术难度较高，不如 Hi - C 常用。TELL seq 则通过生成条形码连接的短读长，组装成人工长读长，可用于小个体或小组织样本的测序和单倍型 phasing。
- RNAseq 辅助基因组注释：RNAseq 数据可提供基因组编码部分的信息，帮助训练基因预测工具，提高基因注释准确性。常规 RNA - Seq 分析短读长 cDNA 片段，但由于可变剪接的复杂性，转录本推断可能不准确。长读长测序方法，如 ONT 和 PacBio Isoform Sequencing（Iso - Seq），可获得全长转录本序列，提高注释质量。Iso - Seq 可生成全长 cDNA 序列，PacBio Kinnex kit 是 Iso - Seq 的进一步发展，可提高通量。
- 质量修剪（phase 4）
- ONT 碱基识别和质量检查：ONT 测序原始数据存储为 pod5（以前为 fast5）格式，需转换为 fastq 格式进行碱基识别。碱基识别软件不断更新，建议及时更新并尝试新软件。FastQC 可用于一般数据质量检查，PycoQC 和 MinIONQC 专为 ONT 数据设计，可分析读长、数量和质量分布。读长过滤、质量修剪和接头去除可使用 pychopper、porechop_ABI 和 nanofilt 等工具，但 ONT 数据质量分数相对较低，过滤时需谨慎，避免丢失过多数据。
- PacBio HiFi 碱基识别、预处理和质量检查：PacBio 在 CCS 模式下测序有两种获取 HiFi 读长的方式，即板载调用和后续从子读长生成 HiFi 读长。板载调用虽减少数据传输量，但会丢失子读长，且某些工具不如 DeepConsensus。DeepConsensus 管道计算要求较高，但可获得更多数据。在运行组装前，需评估 HiFi 读长的总长度、长度分布和理论覆盖度，以判断组装的可行性。
- 基因组组装（phase 5）
- 组装工具选择：有多种工具可用于 PacBio HiFi 数据组装，hifiasm 通常在速度、连续性和准确性方面表现最佳。对于易出错的 ONT 数据，也有许多组装工具可供选择，如 Canu、Racon、Flye 等。不同工具在计算资源需求和准确性上有所差异，Flye 在处理 ONT 数据时表现较好，hifiasm 自 0.21 版本起也能较好地处理 ONT 数据。
- 污染检查：样本中可能存在其他生物的污染，如细胞内寄生虫、共生体或肠道内容物等。这些污染可能导致错误的基因注释和水平基因转移的错误判断。可使用 NCBI Foreign contamination screen、FCS - GX 和 blobtools 等工具进行污染检测和去除。FCS - GX 基于序列相似性识别污染，但数据库可能不完整；blobtools 通过聚类 contigs 和 / 或 scaffolds，根据读长覆盖度和 GC 含量识别污染，使用时需注意其假设条件，如污染与目标物种的 GC 含量差异，且建议结合手动筛选，避免误判。
- Hi - C 数据支架构建：Hi - C 数据可用于确定 contigs 的顺序和方向，实现染色体水平的组装。在进行 Hi - C 文库制备时，若单个样本无法提供足够的 HMW DNA，可考虑混合样本，但需确保映射无偏差且核型相同。Hi - C 文库制备难度较大，可使用 qc3C 工具进行质量检查。Hi - C 读长需映射到 contigs 上，可使用 bwa mem、chromap 等工具，YaHS 是目前用于支架构建的快速且准确的工具之一。Hi - C 数据可视化基于接触图，可帮助判断组装的准确性，在判断染色体臂方向不明确时，检测端粒重复序列可提供帮助。随着 phased assemblies 的发展，双编辑（dual curation）技术可用于检查和纠正单倍型分配错误。
- 组装连续性评估：N50 是常用的评估组装连续性的指标，它表示 50% 的组装总长度所在的序列长度。NG50 则考虑了估计的基因组大小，更适合比较不同物种的组装结果。此外，L50 和 LG50 等指标可反映达到一定比例组装长度所需的序列数量。QUAST/QUAST - LG 等工具可生成这些指标，并与参考基因组进行比较，评估组装质量。
- 组装完整性评估：比较组装总长度与估计基因组大小可评估组装完整性。也可通过将原始序列数据映射到组装上，计算 k - mer 完整性和错误率（如使用 Meryl 和 Merqury 工具），或通过映射读长的覆盖度分布来评估。Benchmarking universal single - copy orthologs（BUSCO）分析通过检测单拷贝直系同源基因的恢复情况来评估组装质量，BUSCO 提供了多个分类群的直系同源基因集，但使用时需注意其代表性。compleasm 是 BUSCO 的重新实现，运行时间更短、准确性更高，建议同时使用二者进行比较。
- haplotig 清除和 phased assemblies：在高覆盖度和高杂合性情况下，组装工具可能产生 haplotigs，影响注释和后续分析。可使用 redundans、purge_haplotigs 等工具清除 haplotigs 或融合重复序列。越来越多的研究需要 phased assemblies，即同时包含两个同源染色体集的组装，这有助于更准确地研究基因组结构和功能。
- 重复序列和蛋白质编码基因的注释（phase 6）
- 结构注释：结构注释主要包括识别重复元件和蛋白质编码区域。转座元件（TE）会干扰蛋白质预测，因此需先识别并屏蔽 TE 和其他重复元件，常用工具如 Repeatmasker/Repeatmodeler。RepeatModeler 可构建重复文库，但会产生冗余信息和假阳性结果，需进一步手动或半自动筛选。基因注释方法分为从头预测和基于证据的方法，通常结合使用以提高准确性。RNAseq 数据可提供转录证据，支持基因边界的精确检测。
- 蛋白质编码基因注释：蛋白质编码基因注释可使用 Augustus、Braker 等工具，Funannotate 适用于多种真核生物基因组注释。还有基于机器学习的方法用于基因结构注释。比较注释工具可利用相关物种的基因组注释信息辅助注释。
- 功能注释：功能注释赋予蛋白质序列特定特征，如基因本体（GO）术语、代谢途径（如京都基因与基因组百科全书 KEGG）、超家族信息等。可使用 InterProScan、eggNOG - mapper 等工具进行功能注释，但对于非模式生物，由于数据库信息不足，注释难度较大。
- 数据公开：为使研究数据和结果可被科学界使用，作者应遵循 FAIR 原则，将原始测序数据、组装和注释上传至国际核苷酸序列数据库协作组织（INSDC）的成员数据库，如 RIOS - NIG、EMBL - EBI 或 NLM - NCBI。同时，建议发表同行评审的文章，详细描述实验和分析过程，确保研究的可重复性。
结论与展望
尽管现代测序技术不断进步，但仍无法完全精确测定整条染色体的序列。目前的测序方法虽能获取大量基因组信息，但基因组组装和注释仍面临挑战。随着全球基因组计划的推进，预计将出现更好的基因组组装和注释标准。机器学习有望改善基因组注释的现状，比较基因组学将更关注结构变异、拷贝数变异、非编码元件和重复元件对生物进化的影响。确保基因组组装和注释的可重复性，公开所有分析参数和脚本，将有助于推动基因组学研究的发展。
