揭秘人类胶原羟赖氨酸半乳糖基转移酶 GLT25D1/COLGALT1：分子结构与酶促机制新解

在胶原生物合成研究中，为明确 GLT25D/COLGALT 酶的作用机制，研究人员对人 GLT25D1/COLGALT1 展开研究。结果揭示其为头对头同源二聚体，确定催化位点在 GT2 结构域等。该研究为理解胶原生物合成提供重要依据。

　　在生命的微观世界里，胶原蛋白就像一座坚固大厦的钢筋框架，支撑着动物组织的形态与功能。从骨骼的强硬到皮肤的弹性，都离不开它的身影。在胶原蛋白的合成过程中，赖氨酸残基的一系列修饰如同精细的雕琢工序，对最终胶原蛋白的性能起着关键作用。其中，α-(1,2)- 葡萄糖基 -β-(1,O)- 半乳糖基 - 5 - 羟基赖氨酸（Glc-Gal-Hyl）修饰模式尤为重要，它就像给胶原蛋白加上了特殊的 “装饰”，让其更好地发挥功能。

然而，在这座微观大厦的构建过程中，有一群 “工匠” 的工作机制却一直蒙着神秘面纱，那就是负责关键半乳糖基转移反应的 GLT25D/COLGALT 酶。虽然科学家们已经知道，在胶原蛋白的合成 “生产线” 上，赖氨酸残基先由 Fe²⁺依赖的胶原赖氨酸羟化酶（LH，也叫原胶原赖氨酸 2 - 氧戊二酸双加氧酶 PLOD）修饰形成 5 - 羟基赖氨酸（Hyl），接着 Hyl 会在 Mn²⁺依赖的半乳糖基转移酶作用下进行糖基化，最后由多功能的 LH/PLOD 酶进一步修饰生成 Glc-Gal-Hyl。但对于 GLT25D/COLGALT 酶，人们了解甚少，只知道它在这一过程中有着不可或缺的作用，而且其功能异常还与多种疾病，如脑小血管疾病、肝脏疾病、骨关节炎等紧密相关。

为了揭开 GLT25D/COLGALT 酶的神秘面纱，来自意大利多所大学和研究机构（包括帕维亚大学、米兰比可卡大学等）的研究人员踏上了探索之旅。他们的研究成果发表在《Nature Communications》上，为我们带来了关于 GLT25D1/COLGALT1 的全新认识。

研究人员运用了多种技术方法来开展这项研究。在蛋白质结构解析方面，他们利用 X 射线晶体学技术，结合实验定相法，成功获得了全长人 GLT25D1/COLGALT1 在无底物状态以及与供体底物 UDP-α-Gal 结合状态下的晶体结构。同时，小角 X 射线散射、负染电子显微镜和质谱光度法等技术也助力他们深入了解该酶的四级结构。在功能研究上，定点突变技术成为关键，通过对特定氨基酸位点进行突变，探究其对酶活性和结构稳定性的影响。此外，还有生化和生物物理方法，如稳态酶动力学分析、质谱检测等，帮助研究人员确定酶的催化特性。

下面我们来详细看看研究的具体结果：

• GLT25D1/COLGALT1 是一种 Mn²⁺依赖的半乳糖基转移酶：研究人员通过建立体外检测方法，发现该酶对 Mn²⁺有强烈偏好，在其他二价金属离子存在时，除了 Mg²⁺能产生较低活性外，几乎没有酶活性。而且，与多功能的 LH/PLOD 酶不同，GLT25D1/COLGALT1 对 UDP-α-Gal 具有特异性，在无受体底物时，对 UDP-α-Gal 的加工能力有限。
• GLT25D1/COLGALT1 具有细长的多结构域架构：通过 X 射线晶体结构分析，研究人员发现该酶每个多肽由两个球状结构域 GT1 和 GT2 组成，它们通过静电和疏水作用相互接触，并由一个 25 氨基酸的连接子相连。虽然两个结构域都与已知的 Rossman 折叠拓扑结构不同，但 GT1 结构域与已知的糖基转移酶更为相似，而 GT2 结构域与已知糖基转移酶的结构同源性较低。
• GLT25D1/COLGALT1 是一种二聚体酶：从晶体结构的不对称单元可以看出，该酶以反平行方式形成二聚体，质量光度法、尺寸排阻色谱 - 多角度光散射（SEC-MALS）和小角 X 射线散射（SEC-SAXS）等实验结果也都证实了这一点。
• 探究 GLT25D1/COLGALT1 二聚化的作用：研究人员通过突变二聚体界面的氨基酸残基发现，虽然二聚化对酶的催化活性并非必需，但它对与伴侣酶 LH3/PLOD3 形成大分子复合物至关重要。
• GT1 和 GT2 结构域都能结合供体底物和金属离子：电子密度分析显示，GT1 和 GT2 结构域都能结合 UDP-α-Gal 和金属离子。在 GT1 结构域，UDP-α-Gal 与金属离子结合在特定区域；在 GT2 结构域，金属离子与 Glu-Asp-Asp（EDD）基序结合，并且结合底物会诱导 C 末端构象变化。
• GT1 结构域的突变影响酶的折叠稳定性：对 GT1 结构域中影响金属离子或 UDP-α-Gal 结合的位点进行突变后，发现这些突变会导致酶折叠稳定性出现问题，无法获得适合生化研究的重组酶样品。
• GT2 结构域负责催化活性：通过对 GT2 结构域进行定点突变，研究人员确定了参与金属离子配位、底物结合和催化的关键氨基酸残基，明确了该结构域是酶的催化位点。
• GLT25D1/COLGALT1 致病突变的分子意义：研究人员对与疾病相关的突变进行分析，发现这些突变会影响酶的结构稳定性和功能，从而导致疾病的发生。
• Mn²⁺在催化过程中短暂结合在 GT2 结构域：通过差示扫描荧光法（DSF）等实验，研究人员证实 Mn²⁺是催化过程中短暂结合在 GT2 结构域的金属离子辅因子。
• GT1 结构域中 Ca²⁺和 UDP-α-Gal 供体底物的作用：研究发现，GT1 结构域中结合的是 Ca²⁺，它与 UDP-α-Gal 一起对维持该结构域的构象完整性起着重要作用。
• MD 模拟支持 GT1 和 GT2 结构域的不同作用：分子动力学（MD）模拟表明，金属离子和供体底物的结合对 GT1 结构域的稳定性影响较大，而对 GT2 结构域的影响较小。

综合来看，这项研究首次解析了全长人 GLT25D1/COLGALT1 的实验结构，并通过多种方法对其功能进行了深入研究。研究结果不仅揭示了该酶的分子结构和酶促机制，还为理解胶原生物合成过程提供了关键信息，同时也为相关疾病的研究和治疗提供了重要的理论基础。它就像一把钥匙，为我们打开了通往胶原蛋白合成微观世界的大门，让我们对生命过程中的这一重要环节有了更清晰的认识。