农杆菌双鸟苷酸环化酶结构域蛋白抑制毒力和菌间竞争的独特策略：开启植物病害防治新视角

本文聚焦农杆菌（Agrobacterium），发现双鸟苷酸环化酶（DGCs）结构域蛋白 DcvA 和 DcvB 可负向调控农杆菌毒力。DcvA 不依赖环二鸟苷酸（c-di-GMP）抑制毒力；DcvB 则通过提高 c-di-GMP 水平，促进生物膜形成，抑制毒力和菌间竞争。该研究为控制农杆菌致病性提供新策略。

　　

研究背景

环二鸟苷酸（c-di-GMP）是原核生物中重要的第二信使，由双鸟苷酸环化酶（DGCs）催化合成，可调节细菌多种生理过程，如生物膜形成、运动性、毒力和菌间竞争等。农杆菌是一类能引起植物冠瘿病或毛根病的土壤细菌，其毒力调控与菌间竞争密切相关，且受环境 pH 等多种因素影响。农杆菌基因组编码多个 dgc 基因，部分 DGCs 可调节生物膜形成，但对毒力和菌间竞争的调控机制尚不完全清楚。基于此，研究人员推测不同的农杆菌跨膜双鸟苷酸环化酶（TM-DGCs）可能通过不同机制调节菌间竞争和毒力，进而开展了对 Atu1207 和 Atu5372（分别命名为 DcvA 和 DcvB）的研究。

研究结果

1. DcvA 和 DcvB 负向调控农杆菌 C58 的瞬时转化和毒力：通过在农杆菌 C58 中过表达 HA 标记的 DcvA 和 DcvB，研究发现它们均显著降低了拟南芥幼苗的瞬时转化效率，且使番茄茎上的肿瘤大小和重量减小。构建单缺失和双缺失突变体后发现，单突变体对肿瘤重量无显著影响，而双缺失突变体 ΔdcvAΔdcvB使肿瘤重量显著增加，但相对瞬时转化效率无显著变化，表明 DcvA 和 DcvB 在农杆菌 C58 毒力调控中起负向作用。
2. DcvA 和 DcvB 下调vir基因转录：进行vir启动子活性分析，将virB或virE启动子与绿色荧光蛋白（gfp）和 β - 葡萄糖醛酸酶（gus）报告基因融合，经乙酰丁香酮（AS）诱导后检测。结果显示，过表达 DcvA 或 DcvB 的菌株中报告基因表达显著受抑制，DcvA 对vir启动子活性的抑制作用更强。RT-qPCR 和蛋白水平检测结果也表明，过表达 DGCs 降低了virB2和virE2的 mRNA 和蛋白水平，而双缺失突变体则使virB2的 mRNA 水平增加，说明 DcvA 和 DcvB 通过下调vir基因转录抑制农杆菌毒力。
3. 过表达 DcvB 导致细胞聚集并触发生物膜形成，而 DcvA 无此作用：研究发现过表达 DcvB 的菌株刚果红染色更强，浮游细胞密度降低，细胞聚集在试管表面，生物膜形成显著增加；而过表达 DcvA 的菌株无这些现象。同时，过表达 DcvA 或 DcvB 均使细胞游泳运动能力下降。由于单突变体和双突变体在生长和生物膜形成方面无明显表型，说明 ΔdcvAΔdcvB毒力增强并非由这些生理变化引起。
4. 过表达 DcvB 通过 GGEEF 基序增加细胞内 c-di-GMP 水平，DcvA 则无此作用：序列分析显示 DcvA 和 DcvB 都含有保守的 GGEEF 基序和 7 个预测的跨膜结构域。构建催化失活变体（GGEEF 突变为 AAAEF）并检测，发现过表达野生型 DcvB 的细胞内 c-di-GMP 水平升高，而 DcvB^AAAEF失去了增加 c-di-GMP 水平和促进生物膜形成的能力；过表达 DcvA 和 DcvA^AAAEF的细胞内 c-di-GMP 水平与对照相当，表明 DcvB 是具有活性的 DGC，其 GGEEF 基序对 c-di-GMP 合成至关重要，而 DcvA 在体内无明显 DGC 活性。
5. DcvB 通过 c-di-GMP 依赖方式抑制vir和 T6SS 基因表达，DcvA 则独立于 c-di-GMP 调节毒力：研究 GGEEF 基序对 DcvA 和 DcvB 调节毒力和 T6SS 的影响，发现过表达野生型 DcvA 或 DcvB 均可抑制 VirB2 积累，DcvB^AAAEF部分恢复了 VirB2 蛋白水平，而 DcvA^AAAEF仍能抑制 VirB2 表达。过表达 DcvB 还降低了 T6SS 组件 TssM 和 Hcp 的蛋白水平，减少了 Hcp 分泌，而 DcvB^AAAEF无法抑制 T6SS；DcvA 和 DcvA^AAAEF对 T6SS 蛋白水平和分泌无影响。RT-qPCR 结果也表明，完整的 GGEEF 基序对 DcvB 介导的vir和 T6SS 基因表达抑制很重要，而 DcvA 抑制vir基因表达不依赖于 c-di-GMP，可能通过其 N 端跨膜区域发挥作用。
6. DcvA 在 VirA 下游抑制毒力：VirA/VirG 是激活vir基因转录的关键双组分系统，ChvG/ChvI 参与激活virG和 T6SS 基因转录。利用磷酸模拟响应调节因子，研究发现过表达 DcvA 在表达磷酸模拟 VirG（VirG^N54D）的virA突变体中仍能抑制vir基因表达和肿瘤形成，而 DcvB 则失去了这种抑制作用，说明 DcvA 在 VirA 下游抑制vir基因表达，而 DcvB 作用于 VirA/VirG 系统上游或与之无关。
7. DcvB 在 ChvG 下游抑制 T6SS 和virG转录：构建组成型激活的 ChvI（ChvI^D52E）突变体并在 ΔchvG突变体中表达，RT-qPCR 结果显示，过表达 DcvB 在该突变体中显著抑制 T6SS 基因表达和virG基因表达，而 DcvA 无明显作用。菌间竞争实验表明，过表达 DcvB 的菌株与大肠杆菌共培养时，大肠杆菌存活率更高，进一步证明 DcvB 通过作用于 ChvG 下游抑制vir和 T6SS 基因表达，而 DcvA 对 T6SS 无明显抑制作用。

研究讨论

本研究发现 DcvA 和 DcvB 作为农杆菌毒力的负调控因子，作用机制截然不同。DcvB 通过提高细胞内 c-di-GMP 水平，促进生物膜形成，同时降低浮游细胞生长、运动性、毒力和 T6SS 活性；DcvA 不增加细胞内 c-di-GMP 水平，可能通过与未知伴侣结合抑制毒力。细菌的 c-di-GMP 信号传导存在全局和局部模式，DcvB 作为全局调节因子影响多个生物学过程，而 DcvA 特异性调节毒力且不依赖 c-di-GMP。并非所有注释的 DGCs 都参与 c-di-GMP 合成，DcvA 的 DGC 结构域可能退化或无催化活性，其跨膜区域足以抑制毒力，推测其可能直接与细胞质中的 VirG 相互作用，阻止 VirG 激活vir基因表达。环境信号可影响 DGC 和磷酸二酯酶（PDEs）激活，但 DcvA 和 DcvB 的 N 端无预测的传感结构域，其调节功能可能依赖表达水平。农杆菌在植物定植过程中可能下调dcvA和dcvB基因，以增强 T6SS 和vir基因表达，促进生态位竞争和感染，未来对相关突变体和过表达菌株的转录组分析有助于验证这一假设。基因冗余使单个 DGC 基因功能研究复杂化，本研究中dcvA或dcvB单缺失无明显表型，但双缺失突变体vir基因表达增加，且 ΔdcvAΔdcvB双突变体在番茄植株上的肿瘤形成增加，而对拟南芥幼苗瞬时转化效率无显著影响，这种差异可能与植物宿主或检测方法有关。此外，双突变体与野生型细胞内 c-di-GMP 水平无差异，表明 DcvB 产生的 c-di-GMP 可被其他 DGCs 补偿，ΔdcvAΔdcvB中vir基因表达升高与 c-di-GMP 无关，这也体现了农杆菌中 c-di-GMP 信号网络的功能冗余。未来结合 DGC 基因的过表达、单缺失和多缺失研究，将有助于深入了解它们的共同和特定调控作用。