HIV-1 衣壳多态性对病毒感染性及对莱那卡帕韦敏感性的影响：揭示潜在治疗挑战与机遇

本文聚焦 HIV-1 衣壳多态性对莱那卡帕韦（LEN）疗效的影响。通过分析超 10,000 个 gag 序列，发现 LEN 结合位点多态性罕见，多数影响病毒感染性但对 LEN 敏感性影响小。这为评估 LEN 临床疗效提供关键依据，对 HIV 治疗和预防意义重大。

　　

引言

HIV-1 大流行已超四十年，至今仍是重大公共卫生挑战，夺走超 4200 万人生命，全球约 4000 万人感染 HIV。尽管高效抗逆转录病毒联合疗法（HAART）已让多数 HIV 感染者（PWH）能正常生活，但每日服药且需近乎完美的依从性以预防耐药，开发长效抗逆转录病毒药物迫在眉睫。

HIV-1 衣壳（CA）蛋白是病毒核心晶格的主要结构成分，在病毒复制周期中起关键作用，包括病毒核心的形成、稳定及在细胞内的运输等，因此成为极具吸引力的治疗靶点。

莱那卡帕韦（LEN，曾用名 GS-6207）是首个靶向 HIV-1 衣壳的抑制剂，能结合在衣壳亚基界面，在病毒复制的早期和晚期都有强大抗病毒活性。早期，它能稳定成熟衣壳核心，阻止其核输入，防止稳定整合 DNA 储存库形成；晚期则干扰病毒粒子成熟，产生无感染性的病毒粒子。此外，LEN 结合位点与多种宿主辅助因子结合位点部分重叠，结合衣壳会干扰宿主辅助因子正常结合，进而影响病毒在细胞内的进程。LEN 对野生型和其他抗逆转录病毒药物耐药的 HIV-1 变体均有效，且因其皮摩尔效价、体内低清除率和缓释动力学，有望成为长效抗逆转录病毒药物，目前正在多项临床试验中进行评估。

在概念验证的 1 期单药治疗研究中，单次皮下注射 LEN 长效制剂能使健康参与者和未经治疗的 HIV-1 感染者血浆中药物浓度维持至少 6 个月。在 2/3 期试验（CAPELLA）中，对于多药耐药的 HIV-1 感染者，半年一次皮下注射 LEN 联合优化背景方案，14 天功能单药治疗后血浆 HIV-1 RNA 平均下降?2.10 log₁₀拷贝 /mL，104 周内病毒抑制率达 82%（HIV-1 RNA < 50 拷贝 /mL），这使其获批用于治疗经大量治疗的 PWH。在预防 HIV 感染方面，3 期 PURPOSE 1 和 PURPOSE 2 研究显示，半年一次皮下注射 LEN 使 HIV 感染率分别降低 100% 和 96%。

然而，在细胞培养和临床研究中，发现 HIV-1 会产生与 LEN 耐药相关的衣壳突变。但对于循环 HIV 毒株中衣壳多态性，尤其是 LEN 结合口袋内的多态性如何影响病毒复制能力和对 LEN 的敏感性，知之甚少。本研究旨在分析 HIV-1 M 组亚型的衣壳序列多样性，并评估 LEN 结合位点多态性对病毒感染性和药物敏感性的影响。

结果

1. 确定 HIV-1 CA 蛋白中靠近结合莱那卡帕韦的残基：利用 LEN 与重组交联衣壳六聚体蛋白的共晶体结构（PDB 6V2F），确定了与结合抑制剂距离在 5 埃以内的所有氨基酸残基侧链，共识别出 29 个残基，这些残基包括与 LEN 直接接触的以及突变后可能与 LEN 接触的，还有对 LEN 结合位点影响可能性较大的第二壳层氨基酸。
2. HIV-1 衣壳序列特征：从洛斯阿拉莫斯 HIV 公共序列数据库下载 23,890 条全长 gag 序列，并结合 825 条来自吉利德赞助临床试验样本的序列，去除重复后得到 10,057 条独特 gag 序列，涵盖 6 个亚型（A1、B、C、D、F1、G）和 2 种循环重组形式（CRF01_AE 和 CRF02_AG）。其中，亚型 B 序列占比最多，为 56.6%，其次是亚型 C 和 CRF01_AE。
3. 衣壳保守性分析：将序列与 HIV-1 HXB2（亚型 B）参考序列比对，计算各亚型 CA 蛋白 231 个氨基酸的保守性。结果显示，亚型 B 中 64.9%（150/231）的 CA 残基保守，整个 CA 蛋白平均保守率达 96.8%；非 B 亚型的保守残基比例也较高。在靠近 LEN 结合位点的 29 个 CA 残基中，多数序列保守性高。
4. 识别 LEN 结合位点内的 CA 多态性：对 29 个感兴趣的残基进行跨亚型氨基酸保守性比较，发现多数 LEN 结合位点残基序列变异程度低。18 个残基出现频率高于 0.5% 的替换，共检测到 54 个衣壳变体。其中，5 个残基（S41、Q50、T54、E180、N183）的替换占所有氨基酸替换的 59%。11 个残基（P38、Q63、M66、Q67、L69、K70、N74、A105、I134、Y130、T186）在所有序列中不变，其中 5 个（M66、Q67、K70、N74、A105）曾被报道与 LEN 耐药相关。所有已知 LEN 耐药相关突变的总体发生率为 0.51%（51/10,057）。此外，还观察到 41 种 2 - 5 个 CA 多态性的组合，但均未包含真正的 LEN 耐药相关突变。
5. CA 多态性对 HIV 感染性的影响：将 54 个变体分别引入基于 NL4.3 的单周期报告病毒中作为定点突变（SDM），在 MT-4 T 细胞系中评估其感染性。结果显示，74%（40/54）的突变体感染性受损（为野生型的 0.01% - 77%），如 I37Y、Q50P 等突变体感染性极低。不同残基的氨基酸替换对感染性影响不同，S41、T54、L56 位点替换耐受性较差，而 Q179、N183 位点替换耐受性较好。
6. CA 多态性对 LEN 敏感性的影响：在 MT-4 细胞中进行 3 天单周期抗病毒试验，测定 LEN 和作为对照的非衣壳靶向抗逆转录病毒药物比克替拉韦（BIC）对野生型和 CA 突变体报告病毒的半数有效浓度（EC₅₀）。54 个突变体中有 6 个因感染性严重受损无法进行表型分析，48 个可分析的突变体中 96%（46/48）对 LEN 和 BIC 仍完全敏感，只有 L56V 和 N57H 对 LEN 敏感性显著降低，分别为 72 倍和 4890 倍，但对 BIC 仍敏感。结构建模表明，L56V 通过引入空间位阻干扰 LEN 结合，N57H 则因失去与 LEN 的关键氢键相互作用而降低敏感性。
7. LEN 耐药性 CA 多态性对 HIV-1 复制能力的影响：将 L56V 和 N57H 引入复制型 HIV-1 报告病毒（NL4.3 株），在原代 T 细胞中评估其复制能力。结果显示，野生型病毒在 14 天内复制活跃，而 L56V 和 N57H 变体复制能力明显减弱，表明这两个 LEN 耐药变体建立有效传播感染的能力下降。

讨论

本研究对 8 种主要 HIV-1 M 组亚型进行遗传监测，识别出 54 种自然发生的衣壳多态性，并测试了每个衣壳替换对 HIV-1 感染性和对 LEN 敏感性的影响。研究发现，HIV-1 CA 序列高度保守，LEN 结合位点 11/29 的残基保守，包括 5 个与 LEN 耐药相关的残基。目前已知的所有 LEN 耐药相关突变的总体发生率很低（0.51%），与先前研究结果一致。

本研究扩展了先前的监测研究，直接评估自然发生的多态性对病毒感染性和药物敏感性的影响。多数鉴定出的衣壳多态性感染性受损，多数多态性不导致对 LEN 耐药，只有 L56V 和 N57H 降低了对 LEN 的敏感性，但这两个变体病毒复制能力也减弱。这可能是因为 LEN 结合位点与多种宿主辅助因子结合位点重叠，多态性可能影响衣壳与宿主的相互作用。

本研究存在一定局限性。一是序列数据集中亚型 B 序列占比过高，而全球流行的亚型 C 和 A 代表性不足，且未涵盖所有循环重组形式和非 M 组变体，可能无法完全代表全球 HIV-1 亚型分布。二是仅在单一 B 亚型（NL4.3）病毒背景下单独评估多态性，不同多态性组合或在不同毒株中的影响可能不同。

尽管如此，鉴于 HIV-1 CA 序列的高度保守性、LEN 耐药多态性的低发生率及其对病毒感染性的负面影响，现有自然 HIV-1 序列多样性对初治个体中 LEN 疗效的影响可能较小。LEN 作为多药耐药 HIV-1 感染者联合治疗方案的一部分已获批，且在预防 HIV 感染的临床试验中进展迅速，本研究结果为其临床应用提供了重要参考。

材料与方法

1. HIV-1 衣壳群体序列分析：从洛斯阿拉莫斯国家实验室下载 HIV-1 gag 序列，去除重复后与 HIV-1 HXB2 参考序列比对，确定亚型。临床数据集中，从患者血浆样本中分离病毒 RNA，扩增并测序 gag 区域，经文库制备、条形码标记和汇集后进行深度测序。
2. HIV-1 衣壳深度序列分析：利用多步骤分析流程评估深度测序结果，包括去除接头序列、排除低质量读数、生成重叠群和比对等，最终生成共识序列并确定亚型。
3. 结构分析：基于 LEN 与衣壳六聚体的 X 射线晶体结构（PDB 6V2F），使用 Bioluminate 软件准备结构模型，确定靠近 LEN 的氨基酸侧链，并评估突变对 LEN 结合的影响。
4. 质粒：使用已描述的 HIV-1 质粒 pKS13Δenv、pHCMV-G 和 pNL4-3-JRFL-secNLuc，合成编码自然发生的 LEN 结合位点多态性的定点突变衣壳基因，并插入相应质粒，经酶切和测序验证。
5. 化合物：HIV 衣壳抑制剂 LEN 和整合酶链转移抑制剂 BIC 由吉利德科学公司合成，制备成 100% DMSO 储存液，?20°C 冷冻保存。
6. 细胞系：HEK293T 细胞和 MT-4 细胞系分别从指定机构获得，在相应培养基中培养并定期传代，维持细胞密度在合适范围。
7. 原代细胞：从健康志愿者的白细胞分离人外周血单个核细胞（PBMCs），分离 CD4⁺ T 淋巴细胞并激活，用于后续实验。
8. 人类免疫缺陷病毒 1 型：通过共转染 HEK293T 细胞制备单周期报告 HIV-1 和复制型报告 HIV-1，收集病毒上清液，定量后冻存备用。
9. 病毒滴定和感染性测定：在 MT-4 细胞中对 VSV (G) 假型化的报告 HIV-1 进行感染性测定，通过稀释病毒并与 MT-4 细胞共培养，测量化学发光信号计算感染性。
10. 抗病毒测定：在 MT-4 细胞中进行抗病毒试验，将测试化合物和病毒加入细胞，培养 3 天后测量化学发光信号，计算 EC₅₀值。
11. HIV-1 在原代人 CD4⁺ T 细胞中的复制动力学：将激活的 CD4⁺ T 淋巴细胞与 p24 标准化的 HIV-1 共培养，定期测量细胞培养上清液中的化学发光信号，监测病毒复制动力学。
12. 统计学分析：使用 GraphPad Prism 10.1.2 软件进行统计分析，采用 Brown-Forsythe 和 Welch ANOVA 检验评估突变体与野生型感染性差异的显著性，P < 0.05 为有统计学意义。