果糖：口腔细菌 “应激战场” 上的关键角色 —— 链球菌代谢与疾病关联新探

本文聚焦于果糖对变形链球菌（Streptococcus mutans）的影响。研究发现果糖代谢可激活与甲基乙二醛、过氧化氢共享的应激反应，影响细菌金属稳态和氧化应激调节，还能增强变形链球菌在多种压力下的生存能力，为口腔微生物稳态和疾病防治提供新视角。

　　

引言

微生物稳态失衡（dysbiosis）与多种疾病相关，碳水化合物代谢在口腔健康中至关重要，而果糖的过度摄入与人类多种健康问题有关，其对细菌生理学及人类微生物组的影响却知之甚少。变形链球菌是口腔致龋病原菌，其对果糖的代谢途径多样，且与甲基乙二醛代谢存在关联。本研究旨在探究果糖对变形链球菌基因调控和生理功能的影响，以及与重要应激因子耐受性的关系。

结果

1. 比较 RNA 测序分析确定应激核心：为模拟人体摄入大量果糖对细菌的影响，研究人员用 50mM 果糖、50mM 葡萄糖、5mM 甲基乙二醛或 0.5mM 过氧化氢（H₂O₂）处理变形链球菌 UA159 菌株，并进行 RNA 测序分析。结果显示，甲基乙二醛处理影响 474 个基因表达，主要引发类似氧化应激反应，包括硫醇稳态、铁硫簇生物合成、活性氧（ROS）清除等相关基因的变化，同时还影响金属离子转运和氨基酸代谢等。
2. 甲基乙二醛调控子与 H₂O₂介导的应激反应比较：甲基乙二醛和 H₂O₂处理存在 115 个共享基因，涉及 ROS 清除、硫醇和金属稳态等功能，但也有各自特异性的基因变化。
3. 果糖、甲基乙二醛和 H₂O₂介导反应的显著重叠：50mM 果糖处理影响 449 个基因表达，与甲基乙二醛有 176 个重叠基因，其中 61 个与 H₂O₂调控子重叠。这些重叠基因涉及硫醇和金属稳态、ROS 清除等重要功能。此外，还发现果糖处理对一些基因的影响比葡萄糖更显著。
4. 果糖和葡萄糖反应的相似性：果糖和葡萄糖处理有 165 个重叠响应基因，包括参与苹果酸乳酸发酵、酸耐受和基因组岛相关基因等，这可能与碳水化合物增加渗透压和产酸有关。
5. 仅受果糖影响的基因：168 个基因仅受果糖影响，涉及碳水化合物代谢的多个途径，如 sppRA、fruRKI 等操纵子的表达变化，还影响 F₁F₀-ATPase 复合物和脂肪酸生物合成途径相关基因，这些变化可能解释果糖特异性表型。
6. RT-qPCR 分析：通过 RT-qPCR 对部分基因进行验证，发现大多数基因的表达变化与 RNA 测序结果一致，且部分基因对果糖和 H₂O₂的响应具有时间依赖性，FruI 介导的效应在果糖处理引发的转录组重编程中仅起部分作用。
7. 果糖影响金属稳态和 Spx 依赖的氧化应激反应：研究发现果糖影响锌排出缺陷突变体的生长，过量的果糖 - 1 - 磷酸（F-1-P）会对金属稳态产生负面影响。同时，果糖对 SpxA1 缺失突变体的生长影响具有培养基特异性，F-1-P 可能通过与 Spx 介导的调节相互作用影响氧化应激反应和金属稳态。此外，果糖能激活 Spx 介导的 sodA 启动子，且 F-1-P 是激活 fruRKI 操纵子的可能变构诱导剂。
8. 果糖有助于在饥饿、酸性 pH 和与产过氧化氢链球菌竞争中的适应性：实验表明，果糖能促进变形链球菌在长期饥饿条件下的存活，在酸性条件下，果糖使变形链球菌培养物的 pH 下降更快且更低，而许多共生链球菌对果糖更敏感。在与产过氧化氢的血链球菌（Streptococcus sanguinis）竞争实验中，果糖增强了变形链球菌的竞争力，且一定水平的 F-1-P 可能更有利于竞争。

讨论

本研究确定了果糖、甲基乙二醛和 H₂O₂共享的应激核心基因，这些基因与酸性应激、氧化还原平衡、金属和硫醇稳态等相关。果糖代谢可能通过多种机制影响甲基乙二醛代谢，且 F-1-P 稳态是链球菌的重要生理信号，在不同浓度下调节链球菌功能。此外，研究还发现了一些对果糖处理有独特响应的转录调节因子，靶向这些因子和 F-1-P 特异性代谢途径可能有助于揭示细菌应对果糖的分子机制。最后，研究强调了果糖与蔗糖在变形链球菌生理学中的联系，但果糖在龋齿发展和生物膜失调中的作用仍需进一步研究。

结论

本研究揭示了果糖在链球菌生理学中的独特身份，它既是可发酵底物，也是应激源和潜在的重要环境信号。与 F-1-P 稳态相关的基因调控有助于细菌在应激条件下的适应性，果糖代谢可能影响细菌对多种应激源的耐受性。这些发现对口腔微生物稳态和全身健康具有重要意义，且可能适用于其他乳酸菌。

材料和方法

1. 细菌菌株和培养条件：使用多种培养基培养变形链球菌和其他链球菌菌株，根据实验需求选择不同培养基，并在特定条件下培养，包括添加抗生素、特定碳水化合物，以及控制温度、气体环境等。
2. 遗传突变体的构建：通过等位基因交换策略和自然转化构建变形链球菌的遗传突变体，使用 Gibson 组装技术连接重组 DNA 片段和抗生素盒，并用 PCR 和 Sanger 测序验证突变体。同时构建启动子 - 报告基因融合体用于研究基因表达。
3. RNA 深度测序、转录组分析和 RT-qPCR：培养变形链球菌 UA159 菌株至早期指数期，用不同处理剂处理后提取 RNA 进行深度测序，分析 RNA 测序数据并进行标准化和统计分析，以确定差异表达基因。通过 RT-qPCR 对部分基因进行验证，并与之前 H₂O₂处理的 RNA 测序数据集进行比较分析。
4. 长期存活实验：将变形链球菌培养物稀释后在特定培养基中培养 11 天，定期取样并通过菌落形成单位（CFU）计数来评估细菌在低 pH 和饥饿条件下的存活能力。
5. 浮游培养中的混合物种竞争实验：使用差异标记的变形链球菌和血链球菌菌株，在含有不同浓度葡萄糖或果糖的培养基中共同培养，通过计算竞争指数评估两种细菌的竞争力。
6. pH 下降和氯霉素乙酰转移酶（CAT）测定：按照已发表的方案进行糖酵解谱分析（通过 pH 下降测定）和 CAT 测定。
7. 统计分析：使用 Prism 软件对实验数据进行统计分析。