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这篇研究对华东地区病猪源大肠杆菌进行 12 年监测，发现 99.12% 菌株呈多重耐药（MDR）。鉴定出 76 种耐药基因（ARGs），如 mcr-1、mcr-3 和 tet (X4) 。还揭示了质粒在耐药基因传播中的作用。研究为防控大肠杆菌耐药传播提供关键依据，助力保障公共卫生安全。
引言
在过去几十年，抗菌药物在畜牧养殖（用于预防疾病和促进生长）以及临床感染治疗方面的应用，极大地推动了人类文明的发展。然而，抗菌药物的不合理使用，促使携带抗生素耐药基因（ARGs）的耐药病原体出现并在全球传播。这一情况导致部分抗菌药物疗效显著下降，一些甚至因耐药菌株的出现而失效。
大肠杆菌（Escherichia coli）是一种备受全球关注的人畜共患病原菌，能够在人和动物之间双向传播。许多大肠杆菌菌株是共生菌，但致病变体可引发从自限性腹泻到危及生命的出血性结肠炎和全身感染等多种临床症状。它还是移动遗传物质的储存库，不断获取和传播耐药决定因子，其基因组可塑性使其能同时携带毒力因子和耐药基因盒，加剧了人畜共患病风险。
全基因组测序（WGS）技术的出现，方便了对 AMR 和毒力主要机制的全面遗传决定因素的识别，这些信息可在各国间交流用于对比分析，加强全球对传染病的控制。此前对大肠杆菌作为 AMR 传播载体的研究多在非选择性条件下，而针对从患病或死亡动物中分离出的大肠杆菌 AMR 的研究较少，本研究旨在填补这一空白。
结果
- 大肠杆菌的流行情况：2010 年 7 月至 2021 年 10 月，从浙江省 11 个城市 82 个农场收集了 114 株来自患腹泻、脾肿大、肝肿大或其他疾病的猪的大肠杆菌菌株。共鉴定出 39 种不同的序列类型（ST）模式，其中 ST88 最常见。不同年份和城市存在多种 ST 模式，表明感染源和传播途径多样。通过平均核苷酸同一性（ANI）和单核苷酸多态性（SNP）分析，发现大肠杆菌可能存在跨时间和跨区域传播。
- 114 株大肠杆菌的耐药性：在 114 株大肠杆菌分离株中，对氨苄青霉素（AMP）和阿莫西林 / 克拉维酸（AMC）的耐药率最高，均为 100%，其次是环丙沙星（CIP，96.49%）、四环素（TET，94.74%）等。99.12% 的菌株对至少三类抗菌药物耐药（即多重耐药），62.28% 的菌株对七类或更多类抗菌药物耐药。对比 2010 - 2017 年和 2018 - 2021 年的菌株，发现 2018 - 2021 年分离株对粘菌素（CS）的耐药率下降，对氟苯尼考（FFC）的耐药率显著上升。
- 大肠杆菌分离株 AMR 相关基因组特征：在所有 114 株分离株中预测出 32 种不同的质粒复制子，平均每个分离株有 4.9 个。IncFIB (AP001918) 质粒最普遍。共检测到 76 种 ARGs，所有分离株至少携带两种 ARGs，80.70% 的分离株至少携带 10 种。许多 ARGs 之间存在显著共现相关性，ARGs 与质粒复制子也存在显著共现相关性。例如，IncI2 复制子与 mcr-1 强相关，通过接合试验证实 IncI2 型质粒可高效介导 mcr-1 基因的水平传播。研究还检测到 mcr-1、mcr-3 和 tet (X4) 等关键 ARGs，其中 mcr-1 在 2018 - 2021 年的检测率显著低于 2010 - 2017 年。
- 大肠杆菌分离株毒力相关基因组特征：在 114 株分离株中检测到 80 种毒力基因，所有分离株至少携带一种毒力基因，77.19% 的分离株至少携带 10 种。terC 基因检出率最高，其次是 traT。一些关键毒力基因如 stb、sta1、stx2A、stx2B 和 astA 在部分分离株中存在，且不同 ST 模式与这些毒力基因存在显著相关性。此外，鉴定出 28 株产志贺毒素大肠杆菌（STEC）、43 株产肠毒素大肠杆菌（ETEC）和 1 株肠致病性大肠杆菌（EPEC），部分携带 mcr 基因的菌株也属于 ETEC 或 STEC。
- 携带 mcr-1 和 mcr-3 质粒的基因组特征：对同时携带 mcr-1 和 mcr-3 的两株大肠杆菌进行全基因组测序，鉴定出携带 mcr-1 的 IncI2 型质粒和携带 mcr-3 的 IncHI2 或 IncHI2 - IncHI2A 型质粒。这些质粒与已报道的同类质粒相比，在结构和基因组成上既有相似性又有差异，如 p204A1 - 223K - mcr3 和 p602A1 - 220K - mcr3 质粒缺少 nimA 基因，呈现出独特的结构。
- 携带 tet (X4) 质粒的基因组特征：在两株对替加环素（TIG）耐药的大肠杆菌中鉴定出携带 tet (X4) 的质粒，分别为 IncX1 型的 p626A1 - 38K - tetX4 和 IncFIA - IncHI1A - IncHI1B 型的 p802A1 - 191K - tetX4。它们与其他携带 tet (X4) 的同类质粒具有相似的骨干结构，且周围区域存在多种 ARGs 和插入序列，具有水平基因转移的潜力。
讨论
猪是大肠杆菌的重要宿主，猪源致病性大肠杆菌对猪健康和养猪业生产力构成重大威胁，同时也是临床相关大肠杆菌感染的主要来源，还是 ARGs 传播的潜在储存库和载体。本研究首次在大地理区域和长时间跨度上，利用基因组学分析病猪源大肠杆菌的耐药特征，发现其多重耐药率极高，对粘菌素的耐药情况令人担忧。
与以往研究相比，病猪源大肠杆菌的耐药性更为严重，这可能与宿主感染和疾病相关条件影响大肠杆菌获取 ARGs 的能力，以及兽医临床滥用抗生素有关。本研究构建了猪相关临床大肠杆菌的详细流行病学框架，发现其 ST 分布具有显著遗传多样性和时空变化，部分优势 ST 与人类肠道外感染的大流行谱系相同，凸显了其人畜共患病风险。
研究还强调了大肠杆菌作为 ARGs 重要储存库的作用，ARGs 与质粒的相关性表明其可能通过质粒结合共同传播。2017 年中国禁止在畜禽养殖中使用粘菌素作为促生长剂后，粘菌素耐药率和 mcr-1 检测率下降，但氟苯尼考耐药率上升，这可能与氟苯尼考的替代使用和共选择压力有关。
此外，ETEC 或 STEC 中存在严重的多重耐药现象，本研究首次在中国鉴定出携带 mcr-3 基因的 ETEC 菌株，部分还同时携带 mcr-1 和 mcr-3 基因，这扩大了对 ETEC 中 ARGs 谱的认识，也凸显了这些菌株对公共卫生的重大风险。携带 mcr-1、mcr-3 和 tet (X4) 基因的质粒在不同宿主和地区的病原体中普遍存在，而携带 mcr-3 的 IncHI2 质粒正在不断进化，需要长期监测。
本研究表明病猪是 AMR 传播的关键载体，鉴定出的关键耐药决定因子威胁着粘菌素等最后手段抗生素的疗效。发现的新型传播模式以及质粒介导的水平基因转移，强调了加强监测和采用 “同一健康” 方法来减轻 AMR 风险的紧迫性。这些发现为未来 AMR 控制策略提供了重要框架。
材料和方法
- 大肠杆菌分离株的鉴定：从猪的病变组织（主要是脾脏、关节、肠道和肝脏）中分离大肠杆菌，先在缓冲蛋白胨水（BPW）中富集，然后在伊红美蓝（EMB）琼脂平板上划线培养，通过基质辅助激光解吸 / 电离飞行时间质谱（MALDI - TOF MS）进行鉴定，以大肠杆菌 ATCC 25922 作为质量控制菌株。
- 抗菌药敏试验：采用肉汤微量稀释法测定大肠杆菌分离株的 AMR 谱，使用 13 种抗菌药物，根据临床和实验室标准协会（CLSI）设定的断点判断耐药性，以大肠杆菌 ATCC 25922 作为对照菌株。
- 全基因组测序和生物信息学分析：提取分离株的基因组 DNA，进行 Illumina 测序和纳米孔 GridlON 平台的第三代测序。使用多种工具进行序列质量检查、组装、基因预测、注释以及各类基因和质粒的检测分析，还进行了多位点序列分型（MLST）、最小生成树分析、平均核苷酸同一性（ANI）分析和系统发育分析等。
- 结合试验：以叠氮化钠抗性的大肠杆菌菌株 J53 为受体，对携带 mcr-1 的 IncI2 型大肠杆菌菌株进行质粒结合实验，通过特定引物 PCR 验证转接合子。
- 统计分析：使用卡方检验分析 AMR 率，用 TBtools 绘制质粒复制子、ARGs 和毒力基因的聚类热图，用 GraphPad 8 进行 Pearson 相关分析确定 ST 与毒力基因、质粒复制子与 ARGs 之间的相关性。
