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本文聚焦肺孢子菌肺炎（PCP）。研究发现，在疑似 PCP 爆发中，三位肾移植受者（RTRs）感染相同基因型肺孢子菌，其 msg-I 基因表达有差异。这表明抗原选择性表达或影响 PCP 发病，且该菌对霉酚酸酯的潜在抗性也推动感染，为 PCP 研究提供新视角。
肺孢子菌肺炎研究背景
肺孢子菌（Pneumocystis jirovecii）是一种机会性真菌，能在免疫功能低下人群的肺部定植，引发严重的肺孢子菌肺炎（PCP）。这些免疫功能低下人群包括 HIV 感染者、癌症患者、炎症或自身免疫性疾病患者，以及实体器官或干细胞移植受者。在过去几十年里，PCP 是常见的侵袭性真菌感染疾病，全球每年约有 50 万例报告。但目前，该病原体尚无长期体外培养方法。
起初，人们认为 PCP 是婴儿期初次感染后真菌的重新激活。然而，通过对实体器官移植（SOT）受者中 PCP 爆发的分子分析，以及动物模型实验，证实了肺孢子菌可通过空气传播在宿主间传播，传播媒介是真菌有性生殖周期产生的子囊和 / 或子囊孢子。现在普遍认为，肺孢子菌的主要储存宿主是定植者。
研究发现，在欧洲不同地区爆发的 PCP 中，SOT 受者感染相同基因型的肺孢子菌，这表明该真菌可能对感染这类患者存在特异性适应。例如，法国发现一种适应 SOT 受者的基因型，其 inosine monophosphate dehydrogenase（IMPDH）基因突变，可能对广泛用于 SOT 受者的免疫抑制剂霉酚酸酯产生抗性；还有研究发现，P. jirovecii的 dihydropteroate synthase（DHPS）基因突变可能导致对磺胺类药物的抗性，进而影响 PCP 的预防效果。
肺孢子菌为逃避宿主免疫系统压力，拥有一套表面抗原变异系统。该系统依赖于六个主要表面糖蛋白（Msg）家族的基因镶嵌，以及约 80 个位于端粒附近的 I 型 Msg（msg-I）等位基因的重排。随着时间推移，单个 msg-I 等位基因会转移到每个基因组中仅有的一个启动子下游，实现互斥表达，从而产生表达不同抗原的微生物亚群。
研究目的
在随机选取的 15 例 PCP 患者中，发现除三位 RTRs 外，其他患者的P. jirovecii msg-I 等位基因库都不同，这提示三位 RTRs 可能涉及 PCP 爆发。本研究的第一个目的是通过确定三位 RTRs 是否感染同一P. jirovecii基因型，来评估这一疑似爆发事件；第二个目的是利用不同患者中相同 msg-I 等位基因库的存在，探究P. jirovecii抗原变异在 PCP 发病机制中的潜在作用，即确定患者中表达的 msg-I 等位基因。
研究结果
基于 msg-I 基因库分析怀疑 RTRs 中存在 PCP 爆发
研究人员随机选取了 15 例瑞士免疫功能低下的 PCP 患者，其中 10 例来自洛桑，5 例来自伯尔尼，包括 6 例 HIV 感染者、3 例 RTRs、2 例癌症患者和 4 例免疫抑制原因不明的患者。通过之前开发的方法，利用 PacBio 环形一致测序（CCS）对通用 PCR 产物进行长读长测序，并借助生物信息学分析来识别和量化等位基因，从而确定患者体内P. jirovecii msg-I 等位基因的 “基因组” 库。结果显示，15 例患者中有 12 例拥有不同的基因组库，等位基因数量在 49 - 185 个之间；而三位 RTRs（BE2、BE3 和 LA10）的基因组库几乎相同，分别包含 56、57 和 54 个等位基因。这三位患者是 15 例患者中仅有的 SOT 受者，且诊断时间相隔数年，他们相同的基因组库和潜在疾病表明，可能存在由单一适应感染这类患者的P. jirovecii基因型引发的 PCP 爆发。
疑似爆发中存在对霉酚酸酯耐药的单一P. jirovecii基因型
通过多位点序列分型对患者体内的P. jirovecii进行进一步研究。结果发现，未参与疑似爆发的患者除 LA2 外，大多是多种基因型共感染，且这些基因型多样，除感染 LA3 的基因型存在 DHPS 基因突变外，其他都没有抗性突变。相反，三位疑似爆发的 RTRs 感染的是同一单一P. jirovecii基因型，与其他 12 例患者不同，且该基因型的 IMPDH 基因存在抗性突变，但 DHPS 基因无突变。对伯尔尼另外 4 例与疑似爆发同期的 RTRs 进行基因分型，其中 3 例感染了相同的耐药基因型，属于疑似爆发病例，第 4 例感染了至少两种其他非耐药基因型。这表明在 6 例 RTRs 中发现的相同单一基因型，与 SOT 受者中 PCP 爆发的特征相符。
不同 SOT 受者爆发中涉及的基因型比较
为深入了解 SOT 受者爆发的病因，研究人员将此次观察到的基因型与之前报道的其他爆发中的基因型进行比较。对法国里昂一次爆发中涉及的 2 例 RTRs 和 1 例 HIV 阳性患者的P. jirovecii进行基因分型，发现其基因型不同，且携带 DHPS 基因抗性突变，但 IMPDH 基因无突变。与之前欧洲其他 RTRs 和肝移植受者爆发中报道的基因型相比，也均不相同。这表明多种P. jirovecii基因型可独立适应感染 SOT 受者。
疑似爆发中 RTRs 的P. jirovecii msg-I 表达库不同
研究人员利用能特异性扩增 msg-I 等位基因的通用 PCR，确定了 15 例患者中P. jirovecii msg-I 等位基因的 “表达” 库。结果显示，所有患者的表达库都不同，包括三位疑似爆发的 RTRs。尽管这三位患者的表达库相关，但仍是不同的子集。通过重复分析三次，进一步确认了他们表达库的差异，这表明在疑似爆发的患者中，存在从几乎相同的基因组库中选择性表达 msg-I 等位基因的现象。
研究讨论
在 15 例随机选取的 PCP 患者中，怀疑三位 RTRs 涉及 PCP 爆发，因为他们感染的P. jirovecii基因型与其他 12 例患者不同。本研究虽未正式证明爆发的原因，但这并不影响研究结论，因为结论并非基于不同患者中相同基因组库存在的原因。
此次疑似爆发持续了至少 8 年，6 例涉及的 RTRs 在 2013 - 2021 年期间被诊断。虽然不排除患者间直接传播的可能，但也可能存在中间宿主，或者患者是通过环境中休眠的真菌形式感染。在伯尔尼，尽管其他 RTRs 感染了耐药基因型，但仍有一位 RTR 感染了不同的非耐药基因型，这说明并非所有 RTRs 都会选择适应感染 SOT 受者的基因型。
本研究中疑似引发爆发的P. jirovecii基因型，与之前 SOT 受者爆发中涉及的 5 种其他基因型不同，这进一步支持了不同基因型可独立适应感染 SOT 受者并引发爆发的观点。该基因型因 IMPDH 基因突变可能对霉酚酸酯耐药，在瑞士疑似爆发中，部分患者使用了霉酚酸酯，这可能推动了感染的发生，而之前里昂爆发中未使用霉酚酸酯的患者感染的基因型则无 IMPDH 抗性突变。
此次研究发现的爆发相关基因型，其 msg-I 基因组库在 8 年中保持稳定，这与之前研究中非爆发患者的 msg-I 基因库多样性形成对比。这种稳定性可能是由于 SOT 受者中重组频率低，或者是缺乏共感染基因型间的交配事件，也可能是P. jirovecii微生物传播过程中重组频率始终较低，而非爆发患者基因库的多样性可能是在大量定植个体中产生的。
在三位疑似爆发的 RTRs 中，观察到从几乎相同的基因组库中表达的 msg-I 等位基因存在差异，不同子集的基因被表达。BE2 患者表达了基因组库中的所有等位基因，这可能与低免疫抑制和 / 或长期感染有关。这是首次在Pneumocystis中报道同一基因库中编码抗原的基因存在选择性表达现象。这种现象可能对 PCP 发病机制至关重要，因为它可使P. jirovecii通过改变表面抗原逃避每个患者的特异性免疫反应。抗原变异可能源于 msg-I 基因起始处保守重组连接元件的基因重组，随着时间推移产生表达不同 msg-I 等位基因的新微生物亚群，这些亚群受免疫选择压力驱动。但这种选择性表达可能会降低每个患者中表达的抗原多样性，进而降低在新的人际传播中逃避新免疫系统的概率。有一种假设认为，每个P. jirovecii群体中都表达了所有 msg-I 等位基因，只是部分表达水平低，用通用 PCR 检测不到，这可以使表达各种抗原的P. jirovecii亚群持续存在而不被消除，这一假设与在感染大鼠和小鼠的Pneumocystis物种中观察到的所有 msg-I 基因表达情况相符，但如果肺泡被证明是无菌的，该假设可能不成立。
研究结论
综上所述，在本研究疑似的 PCP 爆发中，P. jirovecii表面抗原的选择性表达可能通过逃避每个 RTR 患者的特异性免疫反应，在 PCP 发病机制中发挥作用。这是首次在Pneumocystis中报道这一现象，为P. jirovecii和其他人类病原体（如Plasmodium和Trypanosoma）的抗原变异系统功能提供了新的见解。此外，P. jirovecii基因型对霉酚酸酯的潜在抗性也可能推动了疑似爆发期间的感染。研究结果还支持了多种P. jirovecii基因型可适应感染 SOT 受者，从而促进爆发发生的观点。
研究方法
样本和 DNA 提取
从瑞士洛桑和伯尔尼的免疫功能低下 PCP 患者中收集支气管肺泡灌洗液（BAL）样本，患者随机入选，入选标准为实时 PCR 检测P. jirovecii呈阳性且有剩余 BAL 样本用于研究。部分样本量不足，无法确定其中的P. jirovecii msg-I 基因库。使用 QIAamp DNA Blood Mini Kit 从 0.2 mL 的 BAL 样本中提取 DNA，法国里昂的 3 份 DNA 样本自之前研究后一直冷冻保存于 -80°C。
表征P. jirovecii msg-I 等位基因库
之前已描述过表征P. jirovecii msg-I 等位基因基因组库和表达库的方法。利用通用 PCR 从P. jirovecii DNA 中扩增基因库，正向引物位于每个 msg-I 基因起始处的保守重组连接元件内或 msg-I 基因特异性启动子内，反向引物位于每个 msg-I 基因终止密码子后 90 bps 的保守区域内。PCR 产物通过 PacBio CCS 长读长测序进行分析，利用专门的生物信息学流程识别和量化每个 PCR 产物中的P. jirovecii msg-I 等位基因，即将 PacBio CCS 原始读数进行清洗、过滤，并以 99.5% 的序列同一性阈值聚类为 “等位基因”，该阈值对应 CCS 方法的错误率。
排除实验室混淆
通过检查实验过程，排除了实验室混淆导致三位疑似爆发 RTRs 的基因组库几乎相同的可能性。在实验的多个步骤中，这些样本与具有不同基因库的患者样本（BE1、BE4、BE5、LA1、LA2、LA3、LA5 和 LA8）一起处理，且之前研究中携带单个等位基因的两个对照质粒未被含有多种不同等位基因的样本污染。
多位点序列分型进行基因分型
采用之前描述的方法，通过对每个 PCR 产物的质粒亚克隆进行测序来对P. jirovecii进行基因分型，也使用了直接测序 PCR 产物的方法。所用引物之前已有描述，包括核 rRNA 基因操纵子的内部转录间隔区 1、核 26S rRNA 基因内含子、线粒体 26S rRNA 基因可变区、β - 微管蛋白基因第 6 内含子周围区域、细胞色素 b 内部一半区域、二氢蝶酸合酶突变位点跨越区域以及次黄嘌呤单磷酸脱氢酶突变位点跨越区域等。文中等位基因的命名和编号参照相应文献，部分研究中的基因分型结果之前已有发表并在本研究中得到确认。
