动物设施卫生状况对阿尔茨海默病转基因小鼠模型的影响：肠道菌群的关键作用

本文聚焦于阿尔茨海默病（AD）转基因小鼠模型，研究发现动物设施卫生状况影响 5XFAD 小鼠粪便菌群组成和淀粉样病变，常规环境饲养的小鼠菌群失调且认知受损，而 SOPF 环境可避免。该研究对理解 AD 与肠道菌群关系意义重大。

　　

引言

在散发性阿尔茨海默病（AD）的众多发病因素中，微生物群 - 肠 - 脑轴的发现为探究其潜在机制及开发治疗策略提供了新视角。研究表明，调节 AD 小鼠模型的肠道菌群对其病症有积极影响 。比如，抗生素鸡尾酒可预防常用 AD 转基因小鼠模型（如 APP/PS1、APP/PS1 - 21 和 5XFAD 小鼠）的淀粉样蛋白沉积和相关神经炎症；益生菌治疗能防止淀粉样蛋白注射小鼠模型的记忆受损 。粪便菌群移植（FMT）也展现出对 AD 的预防作用，有病例报告显示 FMT 治疗艰难梭菌感染后，患者认知功能的简易精神状态检查表（MMSE）评分有所改善 。同时，AD 患者和相关小鼠模型存在肠道菌群失调，将 5XFAD 小鼠失调的粪便菌群移植到野生型（WT）小鼠中会诱导记忆障碍和神经炎症 。不过，不同研究中的细菌菌株存在差异，这凸显了考虑影响菌群组成因素的重要性，动物饲养设施的卫生状况便是其中之一。本研究旨在探究动物设施卫生状况对 5XFAD 小鼠粪便菌群组成和淀粉样病变的影响，以及将失调的菌群移植到 WT 小鼠中对其认知功能的影响。

材料和方法

1. 动物设施：常规饲养的小鼠在法国马赛的 Faculté de Médecine Secteur Nord, INP, UMR7051 CNRS/AMU 繁殖，特定机会病原体 - free（SOPF）小鼠在法国蒙彼利埃的 Plateau Central d'élevage et d'Archivage, CNRS 繁殖。WT 受体小鼠（C57Bl/6J）购自 Janvier - Labs（法国）。
2. 小鼠：5XFAD 小鼠过表达带有瑞典（K670N，M671L）、佛罗里达（I716V）和伦敦（V717I）家族性 AD 突变的人类淀粉样前体蛋白基因（APP），以及携带 M146L 和 L286V 突变的人类早老素 1 基因（PS1），二者均受神经元小鼠 Thy1 启动子控制。5XFAD 品系（B6/SJL 背景）在 C57BL/6 J 小鼠中回交超过 10 代。实验中，通过 5XFAD 雄性半合子与 WT 雌性杂交获得幼崽，确保幼崽出生时拥有原始菌群。小鼠在各自设施中饲养超过三代，断奶（P21）后，5XFAD^Tg/₀和 WT 同窝小鼠分开饲养，避免不同基因型小鼠之间的食粪行为。小鼠饲养环境为 12 小时昼夜循环（120 - 150 LUX），温度 21 - 24°C，湿度 50 ± 10%，自由获取食物和水（SAFE A03，A04 SAFE）。SOPF 设施中的水经过软化（TH 3.5/4°fH）、紫外线处理和 0.2 μM 过滤，常规饲养则使用自来水。在 SOPF 设施中，小鼠饲养在通风的 501 cm2 笼子（GM500）中，垫料为杨树屑（SAFE select fine）；常规设施中，小鼠饲养在 530 cm2 笼子里，垫料相似，无过滤盖，放置在标准架子上（1284L EUROSTANDARD TYPE II L）。所有动物护理和实验程序均符合国家和欧洲法规（EU directive N°2010/63）以及蒙彼利埃大学的护理指南（authorization B34 - 417 - 24，approved protocol #21222）。
3. 粪便菌群制备和给药：在 5XFAD 小鼠 2 个月龄（淀粉样蛋白开始积累但认知障碍尚未出现）和 6 个月龄（淀粉样蛋白负荷高且认知障碍已出现）时采集粪便菌群 。处死供体小鼠（n = 4 - 8，雌雄混合）后 2 小时内处理远端和近端结肠的粪便内容物。将所有动物的粪便材料混合、称重，以 100 mg/mL 的浓度稀释于无菌 PBS 中，涡旋混合 3 分钟，4°C 下 800 × g 离心 2 分钟，分装后储存于 - 20°C。治疗时，将分装的粪便材料用无菌 PBS 按 1:10 稀释，然后给 WT C57Bl/6J 小鼠（雌雄混合）经口灌胃 100 μL，对照组小鼠给予 100 μL 无菌 PBS。小鼠在 8 - 16 周龄时每周治疗两次。
4. 新物体识别测试：新物体识别（NOR）测试在昏暗房间（20 - 30 Lux）的开放场地进行。第 1 天，小鼠在空竞技场适应 10 分钟；第 2 天，训练小鼠探索两个物体（熟悉物体）10 分钟，然后放回笼中；第 3 天，进行 5 分钟的恢复测试，将其中一个熟悉物体替换为新物体。所有测试过程均录像，盲法分析小鼠主动探索每个物体的时间，计算辨别指数，公式为 [（新物体探索时间 - 熟悉物体探索时间）/ 总探索时间]。
5. 淀粉样蛋白负荷分析：在低温恒温器上切取 35 μm 的小鼠大脑冠状切片，将其安装在载玻片（SuperFrost Ultra Plus）上，置于 Tris - 明胶中，室温干燥 24 小时。第二天，用去离子水（H₂Od）清洗载玻片，脱水，然后在 96% 乙醇（CarloErba）和氯仿（HoneyWell）的 1:1 混合物中室温孵育 30 分钟。再次水化后，在 0.1% 硫黄素 S（Sigma - Aldrich）中孵育 10 分钟，用 70% 乙醇清洗 5 分钟，再用 H₂Od 清洗。用 DAPI 对细胞核染色后，用封片剂（Pertex，Histolab）封片（Marienfeld）。使用直立荧光显微镜（Leica Thunder，sCMOS Leica DFC9000 相机）和 10× 物镜（Plan Aprochromat 0.45）采集拼接图像，设置参数为：Hoechst，发射滤光片中心波长 407 nm，曝光时间 4 ms；GFP：发射滤光片中心波长 525 nm，曝光时间 60 ms。对每只动物的 2 - 3 个切片进行盲法检查，确定海马体和顶叶皮层中淀粉样蛋白沉积物的数量和总面积。
6. 16S rRNA 靶向宏基因组分析：从供体小鼠收集个体粪便，液氮冷冻后储存于 - 80°C 备用。根据法国 Vaiomer 建立的方案，对 16S rRNA 基因的 V3 - V4 可变区进行靶向测序，以确定样本中的细菌种群，工作流程仅针对细菌。提取步骤、文库构建、测序和生物信息学流程已在先前描述 。使用 Vaiomer 基于 Find Rapidly OTUs with Galaxy Solution（FROGS）指南建立的生物信息学流程（包括 LEfSe - 线性判别分析效应大小）分析靶向微生物组序列 。本研究中的 16S rRNA 基因测序数据存储在 ENA 数据库，登录号为 PRJEB86885。
7. 统计分析：在验证数据的高斯分布（Shapiro - Wilk 正态性检验）和样本方差齐性（Brown - Forsythe 检验和 Bartlett 检验）后，通过 ANOVA 和事后检验（Bonferroni 检验）确定 FMT 对物体探索时间的影响。对于辨别指数，使用 Student's t 检验。所有统计检验中，P < 0.05 被认为具有统计学意义，使用 Prism 9（GraphPad，MA，USA）进行分析。宏基因组分析中，比较两组时使用 Mann - Whitney 检验，比较多组时使用 Kruskal - Wallis 检验。

结果

1. 6 个月龄常规饲养的 5XFAD 小鼠粪便菌群失调：对常规饲养的 2 个月龄和 6 个月龄 5XFAD 小鼠粪便样本进行 16S rRNA 靶向宏基因组分析。2 个月龄时，5XFAD 小鼠与 WT 同窝小鼠相比，所有指数的 α 多样性均呈下降趋势，但 β 多样性无显著差异，通过 LEfSe 分析和细菌属相对丰度比较，发现与 WT 小鼠相比，只有少数显著不同的细菌系统发育型 。6 个月龄时，5XFAD 小鼠的 Chao1、Shannon 和 Simpson 指数的 α 多样性显著增加，β 多样性显示两种基因型的细菌种群存在显著差异，细菌属的统计成对比较和相对丰度表明，6 个月龄 5XFAD 小鼠的细菌组成与 WT 同窝小鼠有明显差异，拟杆菌门的比例总体降低。在所有组中都检测到了幽门螺杆菌属，其在卫生状况受限的动物设施中是被排除的 。综合来看，常规饲养的 5XFAD 小鼠随年龄增长出现粪便菌群失调。
2. 6 个月龄 SOPF 饲养的 5XFAD 小鼠粪便菌群未失调：对 SOPF 设施饲养的 5XFAD 小鼠 2 个月龄和 6 个月龄的粪便样本进行 16S rRNA 靶向宏基因组分析，发现两个年龄段的 5XFAD 小鼠与 WT 小鼠在 α 多样性（Chao1、Shannon 和 Simpson 指数）和 β 多样性（Bray - Curtis 和 Unifrac 指数）上均无显著差异。6 个月龄时，两组的细菌组成仍然高度相似，细菌属水平的统计成对比较和分类单元相对丰度也证实了两种表型之间没有主要差异。在 SOPF 设施中，属于 Muribaculaceae 科的一个未知属在注释的前 20 个属中仍然是最丰富的，6 个月龄 5XFAD 小鼠中 Prevotellaceae UCG - 001 属的相对丰度与 WT 小鼠相比没有变化。这表明 SOPF 环境可防止 6 个月龄 5XFAD 小鼠出现粪便菌群失调。
3. 供体饲养环境对慢性粪便菌群移植后记忆改变的影响：将来自常规或 SOPF 环境饲养的 2 个月龄或 6 个月龄 5XFAD 小鼠的粪便菌群通过慢性灌胃给予 WT 小鼠 2 个月，在 16 周龄时用 NOR 测试评估受体小鼠的认知性能。接受载体溶液的 WT 受体小鼠表现出正常的记忆性能，而移植常规饲养的 5XFAD 小鼠粪便菌群的受体小鼠出现认知缺陷，移植 SOPF 饲养的 5XFAD 小鼠粪便菌群的受体小鼠记忆性能与接受载体的小鼠相似 。这表明 5XFAD 小鼠的粪便菌群对 WT 受体小鼠认知功能的影响取决于供体小鼠最初的饲养环境。
4. SOPF 出生的 5XFAD 小鼠在常规环境饲养 18 周后重新出现失调的微生物组：研究发现 SOPF 出生的 5XFAD 小鼠在常规环境饲养 18 周后，粪便样本的细菌组成在 α 多样性上与 WT 小鼠无显著差异，但 Bray - Curtis 差异和 Unifrac 距离显示两组存在显著差异。属水平的相对丰度和成对统计比较表明，WT 和 5XFAD 小鼠在常规环境中的细菌定植存在差异，且它们的菌群组成相对差异比在 SOPF 环境中更大。这证明在常规环境中饲养 SOPF 出生的动物会导致 6 个月龄 5XFAD 小鼠出现粪便菌群失调。
5. 6 个月龄 SOPF 饲养的 5XFAD 小鼠与常规饲养的相比淀粉样病变减少：对 6 个月龄的 5XFAD 小鼠进行研究，发现 SOPF 饲养的小鼠与常规饲养的同年龄小鼠相比，海马体和皮层中的淀粉样蛋白负荷降低。对海马体和皮层切片进行硫黄素 S 染色，结果显示 SOPF - 5XFAD 小鼠皮层中淀粉样蛋白沉积物的数量显著减少（-19%，P = 0.025），皮层硫黄素染色的总面积也显著降低（-18%，P = 0.033），在海马体中虽然没有观察到显著影响，但一半的动物呈现下降趋势。

讨论

本研究探讨了动物设施卫生状况对 5XFAD 小鼠粪便菌群组成的影响，以及将其失调的菌群移植到 WT 小鼠中对认知性能的影响。肠道菌群在大脑生理病理学中的重要性日益受到关注，尤其是在 AD 方面。多项研究报道了 AD 患者和转基因小鼠模型存在肠道菌群失调，其可能由多种外部因素引起，如分娩方式、饮食、身体活动、抗生素使用等，且在 AD 中，肠道菌群失调与疾病之间存在相互关系 。本研究证实 5XFAD 小鼠与 WT 同窝小鼠相比，粪便细菌组成存在年龄相关变化，虽然实验交配策略避免了母体微生物组的混杂影响，但父体肠道菌群也可能影响后代表型，不过本研究中多代饲养在相应设施中应已固定了与饲养设施相关的父体效应。在 SOPF 设施这种微生物多样性受限的环境中，5XFAD 小鼠 6 个月龄时未出现菌群失调，而在常规设施中饲养 SOPF 出生的 5XFAD 小鼠则恢复了菌群失调。对 WT 小鼠进行粪便菌群移植实验发现，常规环境饲养的 5XFAD 小鼠的失调菌群会诱导 WT 小鼠认知障碍，而 SOPF 饲养的 5XFAD 小鼠的菌群则不会。推测常规饲养的 5XFAD 小鼠菌群对受体小鼠记忆的负面影响可能与粪便代谢谱差异有关，而 SOPF 饲养的 5XFAD 小鼠缺乏菌群失调特征，可能延迟了模型表型，导致菌群移植对认知性能无影响。肠道菌群组成还与淀粉样病变相关，本研究中 SOPF 饲养的 6 个月龄 5XFAD 小鼠的淀粉样蛋白负荷低于常规饲养的小鼠。基于此，可推测微生物群组成越简单，动物的认知表型可能越不明显，这一假设可扩展到其他淀粉样变性转基因动物模型。本研究仅聚焦于行为研究和宏基因组分析，未探究潜在机制。在 AD 中，存在代谢改变，如短链脂肪酸（SCFA）、胆汁酸水平变化，葡萄糖代谢失调和脑胰岛素抵抗等，这些都与认知能力下降和淀粉样蛋白积累有关，调节肠道菌群可能影响这些途径。此外，免疫系统失调是 AD 的关键特征，肠道菌群对免疫系统成熟有重要影响，FMT 可能影响受体小鼠的免疫反应。未来研究可通过量化循环炎症介质、免疫细胞和分析神经炎症标记物等进一步探究这些方面。同时，使用无菌（GF）小鼠进行研究也很有意义，虽然 GF 小鼠在认知研究中应谨慎使用，因其存在神经发育异常和神经递质水平改变，但 GF - 5XFAD 小鼠的研究可为理解肠道菌群与 AD 的关系提供更多信息。另外，受体小鼠的年龄也是重要因素，老年小鼠的菌群会损害年轻受体的认知性能，且自我恢复能力有限，FMT 对老年 WT 受体小鼠认知功能的影响还需进一步研究，可使用更定量的测试方法如 Morris 水迷宫或 Barnes 迷宫进行研究。综上所述，动物设施的卫生状况对小鼠模型中 AD 的发展和相关行为缺陷有显著影响。不同环境会改变菌群及其对疾病的影响，导致动物模型出现不同表型。在研究肠道菌群与神经系统疾病（如 AD）的关系时，应考虑使用更接近自然菌群的模型，以提高临床前研究的转化价值。