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本文聚焦海洋中硅藻与细菌的相互作用，研究副溶血弧菌（Vibrio parahaemolyticus）对威氏海链藻（Thalassiosira weissflogii）的影响。通过共培养实验，发现虽对生长影响不大，但改变了其光合效率、色素合成、碳氮代谢等，为理解海洋生态系统提供新视角。
研究背景
在广袤的海洋生态系统中，微藻作为重要的初级生产者，通过分泌各类代谢产物与周围微生物互动，形成独特的 “藻际环境”（phycosphere）。其中，硅藻在海洋初级生产中占据主导地位，约贡献 40% 的海洋初级生产力和 20% 的全球光合固碳量。弧菌（Vibrio）是海洋中常见的异养细菌，常出现在硅藻聚集区，其与硅藻的相互作用备受关注。本研究以副溶血弧菌（V. parahaemolyticus）和威氏海链藻（T. weissflogii）为研究对象，探究弧菌对硅藻生理和基因表达的影响。
材料与方法
实验所用的威氏海链藻 9021 菌株由宁波大学捐赠，培养于优化的 f/2 液体培养基；副溶血弧菌 ATCC 17802 购自北京微生物菌种保藏中心，培养于 2216E 液体培养基。将二者以 1:25 的细胞数比例接种于 1L 灭菌 f/2 液体培养基进行共培养，对照组不添加细菌。实验设置 12h 光照、12h 黑暗的循环，光照强度为 150μmol m?2 s?1，温度 20℃（威氏海链藻培养温度）和 30℃（副溶血弧菌培养温度） 。
实验中，采用显微镜计数法测定威氏海链藻细胞密度；利用特定方法测定叶绿素含量，通过 FluorCam 叶绿素荧光成像系统测量叶绿素荧光参数（如光系统 II（PSII）反应中心光能转换效率Fv/Fm）；使用 Vario EL III 元素分析仪测定碳氮含量；借助 Chitinase Activity Kit 测定几丁质酶活性。
提取总 RNA 后，经 mRNA 富集、片段化、合成 cDNA、PCR 扩增等步骤构建测序文库，在 Illumina NovaSeq 6000 测序平台进行双端测序。利用 fastp 软件过滤数据，HISAT2 软件将 reads 比对到参考基因组，HTSeq 软件筛选差异表达基因（DEGs），并进行主成分分析（PCA）、GO 富集分析和 KEGG 通路富集分析。选取 6 个关键基因进行实时荧光定量 PCR（RT-qPCR）验证，实验数据采用独立样本 t 检验分析。
实验结果
- 生长和光合作用：副溶血弧菌对威氏海链藻的生长影响不显著，培养 20 天后，两组生长速率均显著下降。叶绿素a含量无明显变化，但叶绿素c含量显著降低 85.25%。PSII 的最大量子效率Fv/Fm在共培养条件下与单独培养相比无显著变化。
- 几丁质酶活性和 C:N 比：共培养组的几丁质酶活性比对照组降低 21.8%。实验组碳含量比对照组高 2.75%，占干重约 30.72%，氮含量无显著变化，约占干重 4.9%，C:N 比增加 4.63%。
- RNA-Seq 数据质量分析：构建 6 个 cDNA 文库，高通量测序产生平均 7,007.8 Mb 原始数据和 46.4 Mb 原始 reads。过滤后，清洁数据平均长度为 6,894.7 Mb，清洁 reads 平均长度为 45.8 Mb，平均映射率 81.39%，GC 含量 48.08%，Q20 和 Q30 值分别为 98.36% 和 95.38%，表明测序数据质量高。PCA 分析显示两组样本差异显著且重复性好。
- 差异表达基因分析：共鉴定出 1,536 个差异表达基因，其中 969 个上调，558 个下调。双聚类分析表明不同组基因表达趋势不同。KEGG 富集分析显示差异表达基因主要参与代谢途径和环境适应，如氨基糖和核苷酸糖代谢、植物 - 病原体相互作用等。GO 富集分析发现，在生物过程分类中，氨基多糖代谢、几丁质代谢等多次出现；在分子功能分类中，主要涉及几丁质酶活性、几丁质结合等，表明几丁质代谢受副溶血弧菌显著影响。
- 应激反应基因：共培养下，威氏海链藻中与细胞增殖相关的细胞周期蛋白编码基因显著上调。编码酰胺酶的基因下调，该酶催化吲哚 - 3 - 乙酰胺（IAA 前体）生成，推测 IAA 生物合成减少与副溶血弧菌有关。同时，发现抗菌肽（AMPs）编码基因上调，可抑制副溶血弧菌生长；氧化应激相关基因表达有差异，如过氧化氢酶和过氧化物酶上调，谷胱甘肽还原酶等下调。钙依赖蛋白激酶（CDPKs）编码基因显著上调，暗示信号转导途径可能增强。
- 代谢途径变化
- 三羧酸循环（TCA cycle）：编码异柠檬酸脱氢酶的基因表达略有增加，α- 酮戊二酸脱氢酶复合体中，一个二氢硫辛酰胺脱氢酶（E3）基因上调，两个下调。
- 光合作用和碳固定：参与叶绿素合成的基因大多下调，如胆色素原合酶、尿卟啉原脱羧酶等。硅藻特异性捕光蛋白（Fucoxanthin chlorophyll a/c-binding protein，FCP）编码基因中，10 个显著下调。卡尔文循环中，多个酶编码基因下调，如转酮醇酶、果糖 - 1,6 - 二磷酸醛缩酶等，但编码 Rubisco 的基因无差异表达。部分光合作用相关蛋白编码基因下调，而编码细胞色素 c554 的 9 个基因上调，表明细胞内电子传递增强。
- 糖酵解和糖异生：糖酵解中，丙酮酸激酶（PK）编码基因上调，促进丙酮酸生成；糖异生中，限速酶果糖 - 1,6 - 二磷酸酶（FBPase）编码基因未改变，果糖 - 1,6 - 二磷酸醛缩酶（FBA）在糖异生和卡尔文循环中表达模式一致。
- 几丁质代谢：几丁质生物合成途径起始酶谷氨酰胺 - 果糖 - 6 - 磷酸转氨酶（GFPT）编码基因表达显著增加，几丁质酶编码基因显著上调，几丁质合酶编码基因有 3 个上调、1 个下调，表明几丁质代谢活跃。
- 氮代谢：4 个谷氨酰胺合成酶（GS）编码基因上调，1 个下调；氨甲酰磷酸合成酶（CPS）编码基因下调；硝酸还原酶（NR）编码基因上调，表明氮同化增强。
- RT-qPCR 验证：选取 6 个涉及光合作用、抗氧化活性和几丁质代谢的基因进行 qPCR 验证，结果显示 RNA-seq 和 qPCR 表达趋势一致，证明高通量转录组测序结果可靠。
讨论
- 威氏海链藻生长无显著变化：副溶血弧菌的存在未明显影响威氏海链藻生长，可能是因为藻类通过上调细胞周期蛋白编码基因，调节细胞周期，维持相对稳定的生长速率并增强抗病能力。同时，副溶血弧菌可能提供 IAA，导致威氏海链藻自身 IAA 合成减少，但这一假说需进一步验证。
- 光合作用和碳固定改变：尽管部分光合作用相关基因下调，但威氏海链藻的Fv/Fm比值表明其光合作用仍保持活性，可能存在其他补偿机制。叶绿素a、c含量和 FCP 表达下降，卡尔文循环中多个酶下调，可能与光呼吸有关，光呼吸可适应环境变化、增强胁迫抗性。
- 碳氮代谢变化：微藻与细菌的相互作用涉及碳氮等营养物质交换。副溶血弧菌共培养影响了威氏海链藻的中心碳代谢，如糖酵解和 TCA 循环。氮代谢中，谷氨酰胺合成酶编码基因上调，可能反映微藻对外源铵的利用，C:N 比升高可能意味着氮利用效率增强，但也可能与副溶血弧菌自身有关。
- 几丁质代谢与细胞壁防御：共培养下，威氏海链藻几丁质代谢相关基因发生显著变化。几丁质作为细胞壁主要成分，其生物合成和降解可能是一种细胞防御机制。几丁质合酶基因上调、几丁质酶活性降低，可能增强几丁质生物合成、加固细胞壁，但几丁质酶基因表达与活性的差异暗示存在转录后调控，有待深入研究。
研究结论
本研究首次探索了副溶血弧菌对威氏海链藻影响的分子机制，发现虽 PSII 无显著变化，但叶绿素生物合成、碳氮代谢平衡受损。威氏海链藻可能通过上调细胞周期基因和几丁质生物合成途径维持正常分裂和增殖。未来研究应模拟真实自然环境，利用宏基因组学等技术，深入探究硅藻 - 细菌相互作用。
